贝那普利、氨氯地平、卡维地洛对主动脉内皮细胞单层脂类通透性的影响
【摘要】 目的 探讨血管紧张素转换酶抑制剂贝那普利、钙离子拮抗剂氨氯地平和β?受体阻滞剂卡维地洛对大鼠主动脉内皮细胞单层通透性的影响。方法 分离培养大鼠主动脉内皮细胞（AEC）：将AEC培养在混合纤维素酯微孔滤膜上，8 d 后形成AEC单层进行通透性测定。将长有AEC的滤膜分别用上述三药处理4 h ，置于灌注装置上，用含异硫氰酸荧光素标记白蛋白的高脂血灌注，测定收集液的量和白蛋白、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)浓度。 结果 贝那普利、氨氯地平能够降低AEC单层对水、TC，TG，HDL，LDL的通透性（P<0.01）；氨氯地平降低AEC单层对TC，LDL的通透性更为显著(P<0.001)，卡维地洛作用不明显；只有氨氯地平能够降低AEC单层对白蛋白的通透性。 结论 贝那普利、氨氯地平可减少血浆中脂类渗入血管内皮下，具有潜在的抗动脉粥样硬化作用。
【关键词】 血管内皮细胞单层；通透性；血脂；贝那普利；氨氯地平； 卡维地洛
Abstract： Objective To investigate the effects of angiotensin converting enzyme inhibitor benazepril, calcium channel blocker amlodipine besylate andβ?adrenoceptor agonist carvedilol on the permeability of rat aortic endothelial cell (AEC) monolayers.Methods The method of trauma-free isolation was adopted in the culture of rat AECs. Rat AECs were seeded on the nitrocellulose microporous filters. After an eight days' seeding, the monolayers could be used for measuring the permeability. Before being perfused, monolayers were treated with Benazepril, Amlodipine and Carvedilol for four hours successively. The prepared filters were mounted on the Boydon chambers and perfused with hyperlipemia containing fluorescein isothiocyanate (FITC)?labeled albumin. The fluid filtering through the monolayers and the filter was collected and the albumin concentration was measured. At the same time, the concentrations of cholesterol, triglyceride (TG), high?density lipoprotein (HDL) and low?density lipoprotein (LDL) in the collected fluid were also measure by ELISA.Results Benazepril and Amlodipine decreased the permeability of the confluent AEC monolayers to water, cholesterol, TG, HDL and LDL significantly (P<0.01). Amlodipine had more significant effects than the former two drugs. Carvedilol had no obvious effect.Conclusion Benazepril and Amlodipine may decrease the infiltration of lipids and lipoproteins into the subendothelial space, and can be thus used to prevent and ameliorate atherosclerosis.
Key words： endothelium; capillary permeability; lipoprotein; benazepril; amlodipine; carvedilol
血管内皮细胞通透性增强，使脂类渗入血管壁，是促使动脉粥样硬化的诸多因素之一。据报道，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）、钙离子拮抗剂（CCB）、β?受体阻滞剂等一些用于扩张血管、抗心律失常的药物亦具有不同的抗LDL氧化修饰、抑制平滑肌细胞迁移和增殖、对抗凝血酶受体的作用[1~3]。为了进一步探讨上述三类药物是否可降低大动脉内皮细胞单层通透性，从而抑制血浆中脂类渗入内皮下，本实验在大鼠主动脉内皮单层滤过模型上观察了贝那普利、氨氯地平、卡维地洛对水、白蛋白、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白通透性的影响。
1 材料和方法
1.1 动物与仪器
250 g，27月龄，雄性SD大鼠1只；CO2孵箱（Heraeus，德国）；血脂检测仪（Phtometer 8T 224, 意大利）；荧光检测仪（Hitachi 850）；混合纤维素酯微孔滤膜（上海半岛实业有限公司净化器材厂生产，孔径0.22 μｍ）；DMEM培养基（Gibco）；TG和TC检测试剂为上海名典生物工程公司产；抗kallikreinⅡ抗体Calbiochem产品；贝那普利（诺华 Novatis产品）；氨氯地平(辉瑞Pfizer产品)；卡维地洛（巨能药业Junen产品）。
1.2 方法
1?2?1 大鼠主动脉内皮细胞分离和培养
参照Chen SF的无创性分离法[4]。将SD大鼠 ，经腹腔注射乌拉坦麻醉（2 g/kg），肝素化（1 000 U/只），开胸，经右心室注入无钙镁的Hank溶液冲洗肺及大动脉残血，取主动脉切成1 mm×1.5 mm 动脉环，按10块每45 cm2密度接种于培养瓶中，在含有20%小牛血清的DMEM培养基中培养，培养体系中不加任何抗生素、生长因子及细胞外基质，经60 h 培养后弃去组织块，部分换液，4 d 后传代。第三代AEC融合成单层后消化并接种于自己纤维素酯微孔滤膜上，8 d 后进行通透性测定。另将细胞接种于96孔板，8 d 后倒置相差显微镜下观察AEC呈典型的鹅卵石样结构，经激肽酶kallikrenin Ⅱ抗体间接免疫荧光染色后在荧光显微镜下观察，96% 以上细胞含有血管紧张素转换酶。
1?2?2 内皮细胞单层通透性测定
将长有AEC的滤膜分4组（对照组、贝那普利组、氨氯地平组、卡维地洛组），每组5张。将培养液和用培养液稀释的贝那普利、氨氯地平、卡维地洛（质量浓度依次为5 μg/L，5 μg/L，10 μg/L）分别加于各组膜上，每张膜1 ml，置CO2孵箱内，37 ℃ 孵育4 h。异硫氰酸荧光素(FITC)常规方法标记白蛋白。参照Chen SF等[5]的方法测定AEC单层通透性。对照组灌注液含FITC标记白蛋白0.19 g/L，TC 6.69 mmol/L，TG 2.59 mmol/L，LDL 2.05 mmol/L，HDL 1.95 mmol/L。其余3组灌注液除含上述成分外，还含相应浓度的药物。将孵育后的AEC单层置于灌注装置，用上述灌注液灌注。在9.8 kPa 压力下（模拟主动脉平均压）灌注5 min 。根据收集的滤过AEC单层的液体量和白蛋白浓度（荧光比色法测定）通过AEC单层的液体滤过系数（Kf）和蛋白清除率（ACR）。计算公式：Kf[ml/(cm2·min·kPa)]=[滤过液体量×灌注压]/滤器的有效面积×灌注时间。ACR[g/(cm2·min·kPa)]=滤出液FITC?白蛋白浓度 ×滤过系数。血脂测定采用中华医学会检验学会推荐的方法。TC测定：酶法(CHOD?PAP)；TG 测定：酶法(GPO?PAP)；HDL?C测定：PTA?mg法测定HDL以外的脂蛋白，然后用CHOD?PAP 法测定血清液中的HDL；LDL?C测定：聚乙烯硫酸沉淀法。
1?3 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件，数据以±s表示，采用t检验。
2 结果
2?1 药物对EC单层脂类通透性的检测
与对照组相比，贝那普利、氨氯地平、卡维地洛均能降低AEC单层对TC的通透性，其中氨氯地平作用最为显著。贝那普利、氨氯地平亦能降低AEC单层对TG，aPA，aPB的通透性，卡维地洛无明显作用，结果见表1。表1 贝那普利、氨氯地平、卡维地洛三种药物降低AEC单层对脂类通透性的作用比较(略)
2?2 药物对EC单层水的通透性的影响
与对照组相比，三种药物均可降低AEC单层对水的通透性（以Kf表示）， 卡维地洛、氨氯地平、贝那普利降低Kf程度依次为51% ，45% ， 39% （见图1）。
2?3 药物对EC单层蛋白清除率的影响
与对照组相比，除氨氯地平能够降低单层的蛋白清除率外，其他两药无明显作用（见图2）。
3 讨论
血管内皮细胞附在血管壁内表面上，成为组织与血液之间的屏障，维护血管内外物质和液体交换的平衡。在紧密连接处，内皮细胞骨架actin是通过ZO?1蛋白与细胞膜相连接的。因此actin 的运动可造成EC回缩、EC紧密连接开放、细胞间隙增大，这是EC单层通透性升高的主要原因之一。这一过程是钙依赖性的，钙离子可通过激活酪氨酸激酶，使骨架蛋白磷酸化造成F?actin重排，内皮间隙开放；它还可通过激活PKC介导EC单层通透性的增加[6]。有实验证明，钙离子通道开放剂A23187可使血管壁通透性升高，循环中的脂蛋白进而透过EC，在内皮下堆积，并能进一步影响钙环境的稳定和EC功能[7,8]。钙离子拮抗剂地尔硫卓和维拉帕米均能抑制组胺诱导的小血管通透性增高[9,10]。本实验结果显示，氨氯地平可显著降低AEC单层对水、TG、TC、HDL、LDL的通透性，这可能与其抑制了钙离子内流，使肌球蛋白轻链激酶(MLCK)不被磷酸化，稳定了骨架蛋白从而稳定了细胞间隙，减少细胞间的转运有关。有报道[13]，β?受体阻滞剂卡维地洛对TC，TG无影响。亦有人观察到该药能够降低 TG，CHO，LDL?C，升高HDL?C[14]。一般而言，β?受体阻滞剂能够降低细胞内cAMP浓度，增加mLC的磷酸化，使内皮细胞骨架处于不稳定状态，通透性增加。而本实验在大动脉内皮细胞上观察到β?受体阻滞剂卡维地洛没有增加EC单层对脂类的通透性，可能与该药为兼有α?受体阻断作用的β?受体阻滞剂，无内源拟交感活性有关。其作用机制有待进一步探讨。ACEI降低EC通透性的机制可能与以下两点有关，一方面ACEI可减少血管紧张素Ⅱ的生成，增加一氧化氮(NO)释放，恢复NO/ATII平衡，改善血管内皮细胞功能。另一方面，ACEI的降压作用，使血液对血管的侧壁压降低，血管滤过压降低，液体从血管内向血管外转移减少，血管通透性随之降低。三种药物对白蛋白的滤过影响不一，可能因为可滤过白蛋白的大孔总面积小，只占细胞连接很小的比例，因此细胞间隙的扩大对其影响相对很小，而对小孔则影响明显。当药物稳定了细胞骨架，减少可滤过白蛋白细胞连接的开放，这时经大孔滤过的白蛋白相对变化不大，因而贝那普利，卡维地洛对EC 单层白蛋白清除率的改变不明显。但氨氯地平作为钙离子拮抗剂，可减少Ca2+的内流，从而减少了细胞膜表面白蛋白的结合，减少了囊泡运输，因而EC单层经它作用后，白蛋白清除率显著降低。综上所述，贝那普利、氨氯地平可改变大动脉EC单层的通透性，减少脂类渗入血管壁，具有潜在的抗AS的作用。第2期贝那普利、氨氯地平、卡维地洛对主动脉内皮细胞单层脂类通透性的影响 王晓锋，等
【】
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