磁性细胞分选技术在纯化血小板中的应用

【摘要】  　　目的 应用磁性细胞分选技术对血小板进行分选纯化，并评价分选效果，为血小板免疫功能的研究提供实验基础。方法 血细胞分离机单采外周血中的血小板，分别采用磁性细胞MS柱和LD柱纯化浓缩血小板，采用白细胞绝对计数法对分选前后血小板中的有核细胞进行检测，有核细胞去除率。采用流式细胞术检测分选前后血小板活化膜分子CD62P的表达情况，比较分选前后血小板活化程度差异。结果 分选前血小板基础活化率为（2.39±1.10）%，经LD柱负向分选后为（2.56±1.08）%，MS柱正向分选后为（16.76±4.04）%；MS柱、LD柱分选后有核细胞清除率分别为（98.44±0.24）%及（98.47±0.18）%。结论 LD柱负向磁性细胞分选技术可高效去除有核细胞，且对血小板影响较小。

【关键词】  血小板　磁性细胞分选技术　纯化

　　Abstract： Objective  To purify platelets by magnetic activated cell soring and to evaluate its effect.Methods  Platelets were extracted by MCS+ from donor peripheral blood. To purify platelets by magnetic activated cell soring LD and MS  respectively. To evaluate karyote clearance by leucocount method and to detect the platelets activation grade by flow cytometry method.Results  The karyote clearance of platelets purified by magnetic actitated cell soring LD and MS was （98.47±0.18）% and （98.44±0.24）% respectively. Before separation, the platelets basic activation grade was （2.39±1.10）% and it was （2.56±1.08）% and （16.76±4.04）% after platelets separated by LD and MS. Conclusion  Magnetic actives cell soring LD method could purify platelets effectively.

　　Key  words： platelet；magnetic activated cell soring；purifition

　　血小板是血液中的重要成分，近期研究显示，它不仅与出血、血栓性疾病有着十分密切的关系，而且在免疫过程中起着非常重要的作用。许多对血小板的研究要求使用纯化的血小板，以免受其他细胞或蛋白质的影响，血小板的分离纯化成为许多实验的必要前提。近年来，磁性细胞分选技术（Magnetic actived  cell soring, MACS）因其无需昂贵的大型仪器，操作简便易行，生物样品在分离后生物活性保持良好等诸多优点而备受关注。本研究将MACS用于纯化血小板，为拓展MACS技术的应用范围，研究血小板的免疫功能提供实验基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料和仪器  正向分选MACS MS柱及负向分选MACS LD柱（德国Miltenyi Biotech公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），MCS+血细胞分离机（美国血液技术公司），带CD45、CD61抗体的磁珠（德国Miltenyi Biotech公司），FITC标记CD61抗体及PE标记CD62P抗体（美国BD公司），Leucocount kit(美国BD公司)

　　1.2  方法

　　1.2.1  采集血小板  采用美国血液公司Haemonrtics MCS+全自动血细胞分离机采集15名志愿献血者外周血中的血小板，得浓缩血小板液，备用。

　　1.2.2  MS柱正向分选  分选前用Buffer液快速注满柱子，洗涤MS柱，备用。取1 ml 血小板浓缩液以Buffer液洗涤，300×g 离心10 min，去除上清液，调整血小板浓度为1010/ml。取10 μl，以80 μl Buffer重悬，加入20 μl CD61磁珠，混匀，22 ℃ 孵育15 min，加入2 ml Buffer液洗涤，300×g 离心10 min，彻底去除上清。约107血小板，以500 μl Buffer液重悬， 将血小板悬液注入准备好的MS柱， 用3×500 μl Buffer液洗涤柱子， 从支架上移开MS柱， 放置一个新的收集管，向柱内加入1 ml Buffer液，用助推器收集流出的液体，即为纯化的血小板。

　　1.2.3  LD柱负向分选  分选前用Buffer液快速注满柱子，洗涤LD柱，备用。取1 ml 血小板浓缩液以Buffer液洗涤，300×g 离心10 min，去除上清液，调整血小板浓度为1010/ml。取10 μl，以80 μl Buffer重悬，加入20μl CD45磁珠，混匀，22 ℃ 孵育15 min，加入2 ml Buffer液洗涤，300×g 离心10 min，彻底去除上清。约107血小板，以500 μl Buffer液重悬，将血小板悬液注入准备好的LD柱，收集没被标记而通过柱子的血小板，用2×1 ml Buffer液洗涤柱子，收集所有流出液体，即为未被标记的血小板部分。

　　1.2.4  有核细胞细胞计数  取100 μl 血小板液加入试管中，同时加入含有RNA酶、固定液、渗透液、碘化丙碇的Leucocount kit液400μl ，室温避光孵育5 min，混匀后进行流式细胞术分析。将用Beads调整检测条件，设置流式细胞仪实验条件然后上样检测。在标准微球区设置门G1，在有核细胞区设置门G2，然后进行样本获取,设置Beads区域即为G1，获取微球数为10 000个时停止获取。

　　1.2.5  活化检测  取30μl 分选前后血小板于500 μl 固定液中固定15 min，用ACD液洗涤一次，去上清，加5μl CD62P，避光放置15min，ACD液洗涤一次后去上清，加入200μl ACD液，上机检测[1]。

　　1.2.6  计算有核细胞去除率  有核细胞含量（个/μl ）=（获取有核细胞数/获取的Beads数×每管Beads总数）/检测样品量，其中Beads总数试剂盒标明为50 437个；有核细胞去除率=（分选前有核细胞含量-分选后有核细胞含量）/分选前有核细胞含量×100%。

　　1.2.7统计学方法  数据以±s表示，采用配对样品t检验对数据进行统计分析。

　　2  结果

　　2.1  有核细胞去除率  LD柱分选后，有核细胞去除率为（98.47±0.18%），MS柱分选后，有核细胞去除率为（98.44±0.24）%，两者相比无统计学差异，（t=0.60，P>0.05，n=15）（图1）。

　　A：分选前              B：分选后

　　图1  LD柱分选前（A）和分选后（B）有核细胞去除效果（略）

　　图1中R1?R4计数区内微粒数由对应的G1?G4数值表示。其中G1、G3是绝对计数管内标准微球Beads被检测获得的数值，G2、G4是与Beads同时被检测获取的有核细胞数。依据方法1.2.6中的公式，其中分选前加样量为100 μl，分选后加样量为50 μl，计算分选前有核细胞含量为42个/μl，分选后为0.5个/μl，有核细胞去除率为98.81%。

　　2.2  分选前后细胞活度的检测  分选前血小板活化率为（2.39±1.10）%。经LD柱分选后，血小板活化率为（2.56±1.08）%，分选前后血小板活化率无统计学差异（t=0.43，P>0.05，n=15）。经MS柱分选后，血小板活化率为（16.76±4.04）%，分选前后血小板活化率差异有显著统计学意义（t=13.30，P<0.001，n=15）（表1）。

　　表1  磁细胞分选术纯化血小板引起活化度改变（略）

　　3  讨论
   
　　在研究血小板免疫功能的过程中，为了排除免疫细胞（白细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞等）对血小板免疫研究时的影响，去除血小板悬液中的免疫细胞是非常必要的。传统的密度梯度离心法难于获得高纯度的血小板[2～3]。目前，流式细胞分选系统（FACS）和磁性细胞分选技术（MACS）是常用的两种细胞分离技术。FACS需要昂贵的大型仪器，当细胞呈单行经过系统时对细胞活力影响较大，而且流式细胞仪内部通路很难做到无菌，容易对结果产生影响。而且FACS只适用于正向分选，不适用于血小板的纯化。MACS技术1988年起步，现在已经被广泛用于细胞分离、蛋白质核酸纯化等诸多领域。MACS 分选技术具有处理细胞量大、所得细胞纯度高、费用低、操作迅速、对细胞损伤小、利于分选后保持无菌，及较高细胞活性等优点[4～6]。
   
　　磁性细胞分选技术是利用带有抗体的磁珠与细胞表面标记结合，在经过磁场时磁珠被吸附在分选柱上而达到分离的效果。MS柱分选是磁珠结合到目标细胞上，而LD柱是磁珠结合到非目标细胞上。MS柱正向分选和LD柱负向分选分别使用带有CD61抗体的磁珠和带有CD45抗体的磁珠。它们分别是血小板和有核细胞的表面标志。
   
　　BD Leucocount 试剂盒含有Propidium Iodide (PI)的亲DNA染料，可与有核细胞的DNA结合而着色，不含DNA的细胞，如血小板、红细胞则不会着色[7]。根据这一原理通过流式检测可计算出单位体积内有核细胞的绝对数量。用此法对MACS正、负向分选后残余有核细胞进行计数，发现MACS分选对有核细胞均有很好的清除效果，均可达到98%以上。且正、负向分选对有核细胞的清除效果无显著性差异。
   
　　从有核细胞去除率来看，两种方法无统计学差异（t=0.60，P>0.05）。而从细胞活率改变来看，LD柱分选前血小板活化率为（2.39±1.10）%，分选后为（2.56±1.08）%，血小板活化率并无显著改变（t=0.43，P>0.05）；而MS柱分选前为（2.39±1.10）%，分选后为（16.76±4.04）%，分选前后差异较大（t=13.30，P<0.001）。可见两种方法对血小板活化率改变存在较大的差异。产生差异是由于LD柱分选中磁珠结合在非目标细胞上，血小板可以流畅地通过分选柱；而MS分选磁珠结合在血小板上，被吸附到分选柱上，在洗脱过程中必须克服磁场对血小板?磁珠复合物的吸引力，此物理作用过程激活了部分血小板，使分选后血小板活化率明显升高。
   
　　由此可见，利用磁性细胞分选技术纯化血小板在有核细胞去除率、细胞活度保持方面都达到比较好的效果，磁性细胞LD柱分选是比较理想的血小板纯化方法。

【】
  　　[1] 洪 强,陈汉水.流式细胞术与三种活化血小板检测方法的比较[J].中华检验医学杂志,2006,29(2):150-151.

　　[2] Bogdan W, Urszula K, Lidia M. Cmmparison of platelet aggregability and P?selectin surface expression on platelets isolated by different methods[J]. Thrombosis Research, 2000,99(5):495-502.

　　[3] Hill D J, Griffiths D H, Rowley A F. Trout thrombocytes contain 12?but not 5?lip?oxygenase activity[J]. Biochim Biophys Acta, 1999,1437(1):63-70.

　　[4] Fehse B, Frerk O, Goldmann M, et al. Efficient depletion of alloreactive donor T lymphocytes based on expression of tow activation?induced antigens (CD25 and CD69)[J]. Br J Haematol, 2000,109(3):644 - 651.

　　[5] Schernthaner C H, Hauswirth A W, Baghestanian M, et al. Detection of differentiation and activation linked cell surface antigens on cultured mast cell progenitors[J]. Allergy, 2005,60(10):1248-1255.

　　[6] Trang D T, Huy N T, Kariu T, et al. One?step concentration of malarial parasite?infected red blood cells and removal of contaminating wihit blood cells[J]. Malar J. 2004,17(3):7.

　　[7] Goodfellow K J, Storie I, Granger V, et al. The united kingdom national external quality assessment scheme gating and standardization strategy for use in residual WBC counting of WBC?reduced blood components[J]. Transfusion, 2002, 42(6):738 -746.