角质形成细胞凋亡的分子机制
【摘要】 细胞程序性死亡称为凋亡，很多学者认为角质形成细胞的分化是一种特殊形式的细胞凋亡。许多皮肤病如银屑病、扁平苔藓、湿疹等与角质形成细胞的凋亡异常密切相关，本文综述了角质形成细胞凋亡中起重要作用的基因及其调控的具体分子机制等有关方面的问题。
【关键词】 凋亡；角质形成细胞；分子机制
角质形成细胞(keratinocyte， KC)是人皮肤表皮的主要细胞， 在表皮基底细胞层至角质层的分化过程中， KC最后失去细胞核及相应的细胞器， 目前很多学者认为KC的分化实际上是一种特殊的细胞凋亡。 角化是角质形成细胞的一个重要特征， 在此过程中产生一系列特征性形态学变化： 角蛋白细丝从基底层开始积累、 聚集直至最终充满整个无核的角质细胞； 透明角质颗粒在颗粒层出现； 板层小体（lamellar body）从棘层上部出现并逐渐向细胞周边移动，在颗粒层与细胞膜融合并将内容物排出至细胞间；细胞套膜（cell envelope，CE）从颗粒层开始在质膜下逐步形成并最终取代质膜，其生物化学变化极其复杂。从分子生物学角度讲， 角化是KC分化特异性分子有序表达、相互作用和衍变的结果。长期以来KC被认为只起到机械的屏障作用。80年代发现KC能分泌IL?1后，各国学者陆续发现KC尚能分泌多种细胞因子(IL?3， IL?6， IL?7，IL?8， IL?10， IL?11， IL?12， IL?13，IL?15， TNF?α， TGF?α，TGF?β， GM?CSF， G?CSF， M?CSF，VEGF，bFGF，PDGF，POMC，α?MSH，MGSA等)，故KC可能在细胞的其他生理功能中起到重要作用，并且与皮肤病的发病密切相关[1]。
1 控制角质形成细胞凋亡的调控通路及调控因子
1．1 许多生理和病理性细胞死亡的信号传递可激活由遗传调控的细胞程序性死亡传导旁路而诱导凋亡。由Fas介导的细胞凋亡信号的传递主要是经：caspase 8(caspase，又称半胱天冬酶) 和ceramide(神经酰胺)介导的线粒体?细胞色素C两种主要级连反应途经实现的。凋亡相关的细胞内信号传导旁路迄今尚未完全阐明。何春涤等[2]对正常人角质形成细胞、HaCaT细胞和皮肤鳞状细胞癌细胞等细胞系凋亡相关基因及蛋白的表达进行了研究 。通过培养正常人的KC和永生化的人KC系HaCaT、皮肤鳞状细胞癌细胞系(SCL?1，SCC?12，SCC?13)、上皮样癌A431细胞系等，同时用结直肠癌细胞系SW480和黑素瘤细胞系MeWo作对照；结果在培养的正常人KC、永生化的人KC系HaCaT、皮肤鳞状细胞癌细胞系( SCL?1，SCC?12 ，SCC?13)、上皮样癌A431细胞系等，结直肠癌细胞系SW480和黑素瘤细胞系MeWo中均观察到 CD95 mRNA的表达。仅在作为阳性对照的结直肠癌细胞系SW480观察到CD95L mRNA的表达 ，而在其他所有的细胞培养中均未见其表达。在所检测的培养细胞中，Bax特异性PCR产物表达强度变化不大，而Bcl?2 mRNA的表达却明显不同。还同时应用了内部和外部两套不同的检测Bcl?XL和Bcl?Xs引物，发现抑制凋 亡的Bcl?XL mRNA表达总是强于Bcl?Xs mRNA的表达。应用内部Bcl?X引物，在培养的正常人KC，HaCaT，A431等细胞系中，意外发现一条短的DNA片段，而在SW480和MeWo细胞系中却未见相同的DNA片段。应用免疫印迹(western blot)技术，用抗FasL的单抗，在培养的人KC，永生化的人KC系HaCaT亦未见其表达FasL蛋白，而在已证实的结直肠癌细胞系SW480可见FasL蛋 白表达。应用RT?PCR技术，在培养的人KC及HaCaT细胞系可见Fas mRNA的表达而未见FasL mRNA的表达。应用转基因技术，将Bcl?2基因转入HaCaT细胞系内；并应用细胞培养技术，分子生物学及免疫印迹等技术，用FasL(CD95L)拮抗性单抗CH?11及C2?神经酰胺(C2?ceramide)，诱导转入Bcl?2基因的HaCaT细胞的凋亡，并检测其凋亡的差异；同时检测细胞胞浆内和分离的线粒体内细胞色素C的含量；发现HaCaT细胞经Fas介导的细胞凋亡信号的传递主要是经caspase 8而不是经ceramide介导的线粒体?细胞色素 C途径。
1．2 原癌基因c?myc具有调节细胞凋亡和增殖两个截然相反过程的作用，细胞最后的生死取决于该基因的表达和相互制约的其他因素。在正常皮肤中c?myc能促进KC的增殖，其诱导细胞凋亡的作用受到表达的bcl?2的阻遏。Bcl?2基因家族成员是参与细胞凋亡过程调节的关键基因。该家族包含两类功能相反的基因：一类是抑制细胞凋亡(anti?apoptosis)的基因，另一类是促进细胞凋亡(pro?apoptosis)的基因。Bcl?2家族中抑制和促进细胞凋亡的两类蛋白比例( 如Bax/Bcl?2，Bcl?Xs/Bcl?XL等)可决定细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡。在KC过度增殖的银屑病和扁平苔藓皮损中，KC的凋亡水平是显著增加的。因此，深入研究KC凋亡的分子调控及信号转导机制，有助于阐明某些皮肤病的发病机制，寻找有效的新途径，特别是寻找可利用的治疗干预靶点具有重要的理论与实际意义。实验证实，几乎所有的银屑病皮损基底细胞内的bcl?2蛋白表达下降[3]，推测bcl?2的下调使c?myc诱导细胞凋亡的功能释放，导致在银屑病中过度增殖的KC凋亡。Bcl?2的过量表达，除了在缺乏生长因子状态下可延缓细胞的死亡外，还能防止ROS的产生，间接帮助维持溶酶体膜完整性，从而抑制活化procaspase?8的组织溶解，防止UVB诱导的角质形成细胞凋亡[4]。同时，c?myc的过量表达能使p53对细胞周期的生长停滞作用失效，使细胞绕过细胞周期的G1/S关卡，出现明显的有丝分裂失衡，而异常的有丝分裂信号可进一步诱导细胞凋亡。可见，c?myc蛋白的增加很可能是银屑病KC过度增殖和凋亡重要原因。正常KC内存在结合珠蛋白的mRNA，银屑病、扁平苔藓、湿疹等病损处提取的KC表达的结合珠蛋白水平明显增高。已证明，在应激细胞、DNA损伤细胞中p53蛋白表达明显增加[5]。在实验中检测到银屑病表皮有弱或中等强度p53阳性细胞，提示具有凋亡促进作用的野生型p53在银屑病发病中可能也起着重要的作用。bcl?2是公认的凋亡保护基因，其与细胞凋亡关系密切[6]。银屑病皮损中bcl?2在基底细胞中的表达下调，虽然银屑病细胞凋亡增加的真正原因还不清楚，但表皮基底细胞内的bcl?2的表达下调可能在其中起作用。从而显示患银屑病时c?myc，p53的表达上调和bcl?2的表达下调可能共同激活了角质形成细胞的凋亡途径。银屑病皮损中既有PCNA阳性细胞的增加，又有大量凋亡细胞存在，提示银屑病时的KC凋亡增加与异常的KC活化和增殖密切相关，KC的过度增殖与凋亡增加同时伴随银屑病的发病。银屑病皮损中角质形成细胞凋亡增多是针对细胞过度增殖的一种内在稳态机制，可能与Bax，Fas及Fas?L等凋亡相关分子的异常表达有关，而Fas系统还可能参与银屑病的局部免疫异常。
1．3 正常生长的机体细胞处于一种增殖与抑制增殖的动态平衡之中，促增殖因子的过度表达与抑制增殖成分的缺失都会导致细胞增殖失控进而引起细胞永生化和肿瘤的发生。p53和pRb研究较多的抑癌蛋白。大约50%的人类肿瘤与p53有关，Rb基因的缺失和突变也与多种肿瘤的发生有密切关系，其编码的蛋白pRb处于细胞调控的中心环节：一方面它在控制细胞进入生长分裂周期及脱离细胞周期而进入分化状态的过程中起重要作用，另一方面又受到细胞内外各种信号的调控，以保证其功能与细胞生长、分化状态相适应。HPVE6/E7可介导细胞永生化、转化、肿瘤形成和凋亡等作用。将高危型HPVE6/E7转染角质形成细胞后，对转染细胞p53，pRb表达的免疫印迹分析显示，HPV16E6/E7转染的人角质形成细胞早期出现p53，pRb表达水平降低，并可诱导人角质形成细胞永生化。永生化被认为是细胞向具有恶性生物行为的一个关键步骤。应用Lipofectamine介导法进行转染，筛选阳性克隆，免疫荧光染色检测HPVE6/E7在转染细胞的表达；流式细胞仪分析细胞周期变化；免疫印迹分析p53，pRb表达情况。结果发现免疫荧光染色检测见转染细胞内有HPVE6/E7表达；流式细胞仪显示转染细胞G1期细胞为49.2%比正常角质形成细胞（73.4%）少，S期细胞（39.8%）比未转染细胞（19.4%）增多，免疫印迹分析发现正常角质形成细胞和转染角质形成细胞，均在p53，pRb相应分子量处出现染色带的着色深度均明显弱于正常细胞。认为HPVE6/E7能影响细胞的生长和增殖，其作用可能与p53，pRb有关。pRb表达水平的降低还在HPVE7转化的乳房上皮细胞、人成纤维细胞等细胞中观察到，与E7的表达密切相关，可能与转化细胞抵抗生长休止信号的调控有关。总之，HPV16E6/E7转染人角质形成细胞可以引起细胞增殖周期的紊乱，增殖活力增强，体外培养时间明显延长，其作用可能与抑癌蛋白p53，pRb有关。
2 角质形成细胞的递呈抗原作用
正常KC表达MHC?I类抗原，故当KC恶变或受病毒感染时有可能被自身的CD8+T细胞所杀伤。病损处的KC不但常表达MHC?Ⅱ类抗原(包括DR，DQ，DP)并且还常表达各种CD分子(包括CD36，CD57，CD16，CD54，CD44，CD13，CD14，DD86，CD40，CD60等)和B7?3(BB1)，提示KC可能具有递呈抗原的作用。用转基因技术，使卵白蛋白的一条可与MHC?Ⅰ类分子形成复合物的肽片段表达于KC，发现此种携带内源性抗原的KC，不能刺激幼稚的CD8+T细胞，但能刺激曾接触过该肽片段的CD8+T细胞，使其增殖。此结果说明KC在一定条件下确能递呈抗原。
3 展望
角质形成细胞增殖、分化、死亡（角质层形成）的过程，也可称之为其凋亡的过程，使细胞逐渐分化、成熟，逐渐走向死亡的路程，是受许多相互制约的调控机制精细控制的，当其中任何一环产生异常时，角质形成细胞的凋亡进程就会受到影响，进而产生复杂的病理生理反应，从而导致一系列疾病的发生发展。深入研究其凋亡调控通路及调控因子对于角化异常相关性疾病的研究具有相当重要的理论和实际意义，也为该类疾病的树立一座崭新的路标。
【】
/[1/] Weisfeluer M E,Gottlied A B.The role of apoptosis in human epidermal keratinocytes/[J/].J Drugs Dermatol,2003;2(4):385-91.
/[2/] 何春涤,陈洪铎.正常人角质形成细胞、HaCaT细胞和皮肤鳞状细胞癌等细胞系凋亡相关基因及蛋白表达的研究/[C/].中华医学第十次全国皮肤性病学术会议汇编,2000:28-29.
/[3/] 赵广琼,张信江,李德祥.寻常型银屑病表皮细胞中bcl?2,Fas,p~(53)蛋白的表达/[J/].贵州医药,2005,29(7):587-589.
/[4/] Assefa Z,Garmyn M,Vantieghem A.Ultraviolet B radiation induced apoptosis in human keratinocytes:cytosolic activation of procaspase?8 and the role of Bcl?2/[J/].FEBS Lett,2003,540(1):125-32.
/[5/] 王 平,毕志刚,金淑贤,等.中波紫外线辐射损伤角质形成细胞的p53信号传导通路研究/[J/].中华皮肤科杂志,2006,39(2):83-86.
/[6/] 张敏燕,张正民,韩仲明.凋亡调控基因Bcl?2,Bax与肿瘤/[J/].国外医学耳鼻咽喉分册,2004,28(1):40-44.
