培土生金法对脾虚哮喘大鼠一氧化氮水平改变影响的实验研究

【摘要】  目的：探讨培土生金法防治支气管哮喘的作用机制。方法：建立大鼠脾虚哮喘病证结合模型及单纯哮喘模型，对模型动物支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数(Tot)、嗜酸性粒细胞数(Eos)、血清和BALF上清液中一氧化氮(NO)含量的变化进行了观察。结果：两中药组Tot和Eos数以及NO含量均较相应的未用药组降低(P<0.01)。结论:培土生金中药可延缓大鼠哮喘的发生，可通过降低NO含量改善NO代谢而起到一定的哮喘的作用。

【关键词】  培土生金法；脾虚证；哮喘；一氧化氮；实验研究；大鼠

    依据培土生金法组方的益气定喘汤在实践中对支气管哮喘防治效果较理想。为探讨其机理，笔者建立了大鼠脾虚哮喘病证结合的模型,以动物支气管肺泡灌洗液(BALF)中总细胞数(Tot)和嗜酸粒细胞数(Eos)、血清及BALF中一氧化氮(NO)含量为观察指标,探讨培土生金法对大鼠脾虚哮喘的防治作用及其作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物分组及造模  健康SD大鼠(辽宁中医药大学实验动物中心提供)50只，雄性，体重120-180g，月龄4-6周。随机分为5组:病证结合(脾虚哮喘)组(A组)、病证结合中药组(A1组)、疾病(哮喘)组(B组)、疾病中药组(B1组)和正常对照组(C组以下简称“对照组”)。每组10只。将动物正常饲养3d，使之适应环境后，A组、A1组动物先行脾气虚证造模,采用饮食不节加疲劳过度综合因素伤脾的方法［1］,共8d。两组动物均出现体重下降；食量减少、水量增多；肛温略升高；大便时溏；倦怠、少动；背毛欠光泽等变化，提示造模成功。第9d,参照方法［2］，实验四组动物均以10%卵蛋白溶液lml腹腔注射致敏。第15d始,以1%卵蛋白溶液用超声雾化器喷雾激发。喷雾在雾化缸内任事先置于缸内的动物自行吸入。每次喷雾30s,罩内时间1min。隔日1次，共3次。正常对照组以等量生理盐水代替卵蛋白溶液，其余处理同实验组。

    1.2  中药及给药  培土生金中药(益气定喘汤)：本方由补中益气汤合玉屏风散化裁而成，由黄芪、人参、防风等9味药按一定比例组成。常规煎煮2次,浓缩至1g生药/ml。按人鼠剂量换算，给成人等效量的10倍。于致敏后第10d开始，A1和B1组动物均以1ml中药/100g体重灌胃，日1次，共给药10d。对照组以等量生理盐水代替。

    1.3  BALF液采集及处理  喷雾激发完成后次日,各组动物均以25%乌拉坦(2.5g/kg体重)腹腔注射麻醉。待麻醉后，以5ml注射器行腹主动脉抽血，留血2ml，以1000r/min离心10min，留上清液,存放于-20℃冰箱，用于检测NO。行腹主动脉放血，切开气管，插管，用一次性注射器抽取生理盐水10ml(37℃)，缓慢注入气管内，停留1min，并缓慢抽吸出来。再重复操作2次。第2次、第3次生理盐水量分别为8ml和6ml。3次抽吸液均注入置于冰中的器皿中合并,双层无菌纱布过滤，去泡沫，取滤液，并记录各样品总量。以1000r/min离心10min,上清液存放于-20℃冰箱，用于检测NO。离心的细胞沉淀分别取1ml用血细胞计数器以Liu  Stain染色后计数Eos。

    1.4  主要仪器及试剂  DS?88型自动计量仪，7151型半导体温度计，均为上海医用仪表厂生产；上海产721分光光度计(由本院附属放免室提供)； NO测试盒由南京建成生物工程研究所提供，NO检测采用硝酸还原酶法，按试剂盒说明书进行操作。

    1.5  统计学处理  采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理。采用多元方差分析，用LSD法进行均数间两两比较，结果以平均数±标准差(±s)表示。

    2  结果

    2.1  各组动物BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数的比较  见表1 表1  各组大鼠BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数比较

    2.2  各组动物血清及BALF中NO含量的比较  见表2表2  各组大鼠血清及BALF中NO含量的比较

　　3  讨论

    近年来，人们认识到哮喘是一种多种细胞、炎性介质和细胞因子介导的具有复杂免疫机制的气道慢性炎症疾患，其主要临床特征是气道的高反应(AHR)，且在缓解期依然存在［3］。AHR是哮喘重要的病理生理特征，而气道炎症是AHR形成的关键原因。嗜酸性粒细胞(Eos)在此炎症中起到极为重要的作用，在过敏性和非过敏性哮喘都以Eos浸润和激活为最终共同途径［4］。本研究结果表明，哮喘(A和B)组大鼠Tot、Eos显著升高(与C组比P＜0.01)，提示本实验哮喘大鼠存在着较严重的气道炎症，而培土生金中药处理的A1和B1两组大鼠的Tot和Eos均较相应的阳性对照组(A和B)组显著下降(P＜0.01)，说明培土生金中药可减轻脾虚哮喘和哮喘动物的气道炎症，但培土生金中药处理的A1和B1两组的Tot和Eos仍未恢复至正常水平(与C组比P＜0.01或P＜0.05),考虑与用药时间有关，可在下一步实验中适当延长给药时间继续观察。

    NO是界10个最小的分子之一，是一种气体性自由基。不同浓度的NO具有不同的作用［5］。一方面，由cNOS诱导产生的少量NO在气道局部起保护作用，是支气管扩张剂,可松弛气道平滑肌，在气道平滑肌张力调节和肺部防御功能中发挥作用，同时，它又作为引起支气管舒张的非肾上腺能非胆碱能神经的神经递质而存在［6］；另一方面,由iNOS诱导产生的大量NO是引起气道慢性炎症的细胞毒性分子，可导致AHR,并且通过影响支气管微循环及机体的免疫防御功能等而参与哮喘发病过程。有实验研究表明，哮喘病人呼出气中NO含量较正常人高2～3倍［7］,提示哮喘的呼吸道炎症与NO的大量生成有关。哮喘是由多种炎性细胞参与的慢性气道变态反应性炎症,Eos在此炎症过程中起到极为重要的作用。哮喘患者血和肺组织中Eos增加，Eos计数与哮喘的严重程度密切相关［9］。Eos在气道消退的重要方式是Eos凋亡,NO可阻断FAS受体介导的Eos凋亡［10］。Beauvais等［11］通过检测培养人外周血Eos凋亡发现，NO供体具有抑制Eos凋亡的作用，因此认为NO抑制Eos凋亡在介导和放大Eos炎症中起重要作用。本研究结果表明，哮喘(A和B)组大鼠均存在NO水平升高(与正常组比较P＜0.01)，提示哮喘大鼠存在NO代谢失常，而经培土生金中药处理的A1、B1两组大鼠的NO水平均较相应的阳性对照(A、B)组降低(P＜0.01)，并且两中药(A1、B1)组的血清NO含量及B1组BALF中NO含量与C组比较差异不显著(P＞0.05)，提示该方药可显著降低血清及BALF中NO含量，纠正NO水平失衡，有助于缓解气道炎症，从而对哮喘起到防治作用。

    本实验结果表明,脾气虚哮喘(A)组动物的Eos、Tot、BALF及血清中NO含量等几项指标的改变均较单纯哮喘(B)组为重(P＜0.01),但经过中药处理后的A1和B1组各指标间均无显著性差异(P＞0.05)。说明该方对脾虚哮喘的效果尤佳。近年来的研究表明，脾虚时机体存在自由基代谢的异常［12］，NO作为一种脂溶性极高的小分子气体自由基，可能参与介导了许多病理生理过程，有实验证明，脾虚患者体内NO水平升高，经健脾方药后有明显改善［13］，提示NO水平失衡亦是脾虚证的分子生物学基础之一。

    本实验结果说明，培土生金中药可能是通过降低NO含量，纠正NO水平失衡，减轻气道炎症，从而延缓哮喘发生和减轻哮喘发作的严重程度，长期应用健脾益肺方法有利于哮喘这一慢性气道炎症疾病的治疗。本方的确切药理作用机制仍有待于进一步揭示。

【】
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