大鼠肾阴阳虚模型建立方法
【摘要】 复制大鼠肾阴阳虚模型。方法：甲状腺抑制剂丙基硫氧嘧啶（PTU）大鼠灌胃，甲状腺素片灌胃。结果：大鼠出现中医肾阴阳虚证候的临床表现，肾阳虚组大鼠cAMP/cGMP比值较阴虚组下降，阴虚组比值较空白组明显升高。结论：利用丙基硫氧嘧啶制造大鼠肾阳虚模型，用甲状腺素片制造阴虚大鼠模型是可行的。
【关键词】 模型 动物 大鼠 肾阴虚 肾阳虚
近年来随着中医药事业的迅猛，在中医药科研中模拟中医临床证候的动物病理模型的建立越来越重要。最早建立的肾阳虚模型是祁广?教授的氢化可的松动物模型，其后各种中医证候模型的建立方法相继出现，本实验主要是研究甲状腺激素抑制剂丙基硫氧嘧啶建立肾阳虚动物模型，甲状腺素片建立肾阴虚动物模型的可行性。
1 实验材料
1.1 实验动物 Wistar大鼠SPF级30只，雄性，体重(200±20) g［北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2002-0003］。
1.2 实验药品 丙基硫氧嘧啶(德国瑞姆斯制药股份公司赫尔布兰德分部生产，50 mg/片，进口药品注册号H20060262)，甲状腺素片(天津君安生物制药有限公司生产，40 mg/片，批准文号：国药准字H12020111)。2.2 金银冠心汤加生脉饮制剂对Iso诱发小鼠急性心肌缺血常压耐缺氧存活时间的影响 取18～22 g雄性小鼠54只，随机分为6组：正常对照组、模型组、金银冠心汤加生脉饮高剂量组、中剂量组、低剂量组、脑心安组，每组9只，给药方法同2.1。
于末次给药45 min后，除正常对照组外，其余各组均皮下注射Iso 0.015 g/kg制备小鼠急性心肌缺血模型。Iso给药15 min后，将每只小鼠分别放入盛有20 g钠石灰的250 mL密闭容器中，观察死亡情况，并记录小鼠存活时间，以呼吸停止为指标。
2 实验方法
2.1 给药 将大鼠分为3组，空白组、阴虚组、阳虚组，每组10只，于每日9：00开始灌胃，其中阳虚组用丙基硫氧嘧啶100 mg/kg［1?2］配制成5 mg/mL悬混液灌胃，阴虚组用甲状腺素片150 mg/kg［3］配制成10 mg/mL悬混液灌胃，空白组给相同剂量的生理盐水灌胃。
2.2 方法 实验开始第1 d测大鼠体重并开始灌胃，每天定量给水给食以便纪录24 h饮水量以及食量。每日20：30观察大鼠的一般状态实验，纪录各组大鼠一般状态的变化。实验共4周，每周测体重1次，纪录大鼠体重变化，前3周各测大鼠肛温1次。第4周股动脉放血处死，测试各项指标。
3 实验结果
3.1 一般状态的变化 通过4周的实验观察，第1周3组大鼠一般状态基本无差异，第2周阳虚组大鼠饮水量较空白组稍减少，夜间活动也较空白组减少，第3周阳虚组大鼠出现弓背倦怠，毛发枯泽，爪甲颜色较空白组稍浅，大便较空白组稀软，第4周阳虚组大鼠明显较空白组大鼠出现了毛发无泽，弓背倦怠，较阴虚组大鼠易于抓取，饮食饮水量下降，大便清稀多尿，爪甲颜色变淡，尾巴发凉等症状。阴虚组大鼠第1周与空白组无明显差异，第2周出现多动，烦躁，饮水量增加，进食量增加，体温上升，大便干燥，第3周出现毛发干枯，不易抓取，易激动，第4周出现阴虚症状较前3周更为明显。空白组大鼠除体重增加外其余较以前无变化。
3.2 体重变化 实验周期4周，每周进行称重，从4次测得大鼠体重可以看出，阳虚组体重增长明显慢于空白组。大鼠体重比较见表1。表1 3组大鼠体重比较 注：第4周与空白组比较，两组体重均明显下降△P<0.05
从数据可以看出空白组大鼠体重一直在增长，而2个模型组第4周大鼠体重较第1周都有下降，结果符合中医阴虚阳虚证候的临床表现。
3.3 肛温变化 见表2。
表2 3组大鼠肛温比较 注：第3周与空白组比较，阳虚组较空白组降低#P<0.05，阴虚组较空白组明显升高##P<0.01。
结果分析：数据显示第3周时各组肛温出现差异，其中阳虚组较空白组降低P<0.05，阴虚组较空白组明显升高P<0.01，阳虚组较阴虚组明显降低P<0.01。实验结果符合中医阴虚、阳虚证候的临床表现［4］。
3.4 T3、T4比较［5］ 甲状腺激素其基本作用是诱导新生蛋白质包括特殊酶系的合成，调节蛋白质、碳水化合物和脂肪，以及水、盐和维生素的代谢。甲状腺激素过量使用可致医源性甲亢，甲亢临床典型表现：急躁，哆嗦，怕热，多汗，口干多饮，多食，消瘦，心悸，心音有力；该药可使动物免疫功能低下，部分免疫器官出现病理改变；能造成下丘脑—垂体—肾上腺轴、甲状腺轴、性腺轴不同程度的功能紊乱；使动物自主神经功能出现紊乱，躁动，易激惹，出汗多，怕热；使物质代谢、能量代谢增强，而上述这些表现符合临床肾阴虚证病理改变的结果，所以运用甲状腺素造阴虚动物模型是可行的。
甲状腺机能减退者体内的代谢普遍减慢，基础代谢率降低，中医辨证甲减患者大多具有脾肾阳虚症状，以温肾补阳药，临床症状好转，基础代谢率升高，血浆cAMP升高，因此抑制动物甲状腺功能造成的阳虚动物模型，可摸拟人类的阳虚症。
样本处理：实验第4周取血，各组大鼠取静脉血各2 mL，离心机3500 r/min分离血清测试。
检测方法：用放射免疫法测定血清中T3、T4含量。 表3 3组大鼠T4比较表4 3组大鼠T3比较注：与空白组比较，阳虚组下降△P<0.05，阴虚组明显升高△△P<0.01，阳虚组较阴虚组明显降低##P<0.01。
血清甲状腺素T3、T4含量升高或有一项升高，反映甲状腺轴有一定程度的功能紊乱。阳虚模型的甲状腺中T3，T4含量下降。阴虚模型则相反，实验数据说明模型复制成功。
3.5 cAMP、cGMP比较 血浆环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)是一对相互拮抗而又相互制约的物质，它们对细胞功能处于稳定状态具有双向控制调节作用，与祖国医学的阴阳学说有相似之处，多数研究结论认为血浆环磷酸腺苷升高，说明机体处于一种阴虚状态，反之则是阳虚状态。因此cAMP/cGMP的比值升高则阴虚，反之为阴虚［6］。
样本处理：第4周取静脉血1～2 mL，注入含DETA抗凝剂50 μL的试管中，摇匀，1 h内离心，4℃，2000 r/min离心10 min。分离血浆，-20℃保存，严禁反复冻融。取0.1 mL血浆，加入2 mL无水乙醇，振摇1 min，静置5 min，3000 r/min离心10 min。将上清液倒入指形管或者青霉素小瓶，残渣再加入75％乙醇1 mL，匀浆，3000 r/min离心10 min。合并上清液，于60℃烤箱中吹干，残渣放入4℃冰箱保存。测量时用1 mL醋酸缓冲液溶解，然后取0.1 mL测量，此时稀释倍数为100。
检测方法：用放射免疫法测定血浆中cAMP、cGMP含量。
检测结果见表5，表6，表7。表5 各组大鼠cAMP比较 注：与空白组比较，阳虚组无差异，阴虚组明显升高#P<0.01。阳虚组较阴虚组明显降低△P<0.01。表6 各组大鼠cGMP比较注：与空白组比较无差异，阳虚组较阴虚组无差异。 表7 各组大鼠cAMP/cGMP比较（ 注：与空白组比较，阳虚组无差异，阴虚组明显升高#P<0.01。阳虚组较阴虚组明显降低△P<0.01。
通过检测可以看出28 d时，阴虚组大鼠血浆cAMP较空白组明显升高，cGMP无明显差异。阳虚组大鼠无差异。本实验中阳虚模型组比值与空白组无差异，较阴虚模型组明显降低，阴虚模型组较空白组显著升高，提示阴虚模型组基础代谢率升高，阳虚组基础代谢率相对较低符合其模型表现。
3.6 结果分析 从实验结果来看，阳虚组大鼠体重、体温明显下降，一般状态表现符合中医肾阳虚的表现，阴虚组大鼠体重下降，体温升高，一般状态表现符合中医肾阴虚表现，实验室测试表明，阳虚组cAMP/cGMP值较阴虚组明显下降［4?7］，提示阳虚组大鼠基础代谢率较阴虚组大鼠明显下降，结果表明模型复制基本成功。上述实验结果表明，通过甲状腺激素轴的调解来复制动物阴虚、阳虚模型是可行的，有效的，可以进行进一步研究。
4 讨论
中医证候模型的复制是现在中医学的一个难题，随着中医化进程的深入，这个问题越来越受到国内外医家的重视，本实验在前人经验的基础上，从甲状腺激素轴调解的角度来复制中医肾阳虚、肾阴虚模型。从实验结果观察，本实验所复制的模型在临床表现上符合中医肾阴、阳虚的表现，实验室检测cAMP/cGMP比值也符合模型的要求。总体来看从甲状腺激素调解的角度来复制中医肾阴、阳虚动物模型是可行的，同时本实验也存在一定的不足，如造模方法与中医证候形成的原因不同，模型成功的评价标准等问题还有待进一步研究。
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［1］卢文丽,方肇勤.阳虚证动物模型的造模方法与评析［J］.上海中医药大学学报.2004,18(4):45?48.
［2］沈绍群.甲状腺机能减退症动物模型研究进展［J］.华西医学,2006,21(2):416?417.
［3］付小玲,方肇勤.阴虚证动物模型诊断指标与评析［J］.上海中医药大学学报,2004,18(2):52?54.
［4］陈英华,欧阳轶强.肾阳虚证动物模型规范化研究中诊断指标选择的初步探讨［J］.中医基础医学杂志,2003,9(10):26?30.
［5］卢文丽,方肇勤,潘志强,等.小鼠气、血、阴、阳、虚等八种模型四诊的比较和评价［J］.中国中医基础医学杂志,2006,12(6):433?438.
［6］卢文丽,方肇勤.阳虚证动物模型诊断指标与评析［J］.上海中医药杂志,2005,39(4):42?45.
