外周血树突状细胞与HBV慢性感染的研究进展
【关键词】 树突细胞； 乙型肝炎病毒； 感染
树突状细胞（dendritic cell, DC）是起源于骨髓的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC），具有启动T细胞介导的免疫应答功能，因其表面具有众多树突状突起而得名，由美国学者Steinman及Cohn于1973年发现［1］。自从Romani等［2］建立了应用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte?macrophage colony?stimulating factor，rhGM?CSF）和重组人白介素?4（rhIL?4）从人外周血大规模培养制备DC的方法后，人们又建立并完善了多种培养扩增DC的方法，这使得对DC的研究得以深入。它在感染免疫应答中具有重要作用，并在肿瘤免疫、器官移植和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B）的治疗中引人注目。但是，目前对于DC与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染的相关机制仍未清楚，故就此研究作简要综述。
1 DC的生物免疫学特性
1.1 DC的基本特性 Steinman［3］阐述了DC与功能相关的几大特性：①DC具有捕获加工处理抗原的能力；②DC高表达MHC?Ⅱ类产物；③DC表达丰富的粘附分子及共刺激因子，如ICAM、LFA3、整合素、B7、CD40和IL?12等，这涉及到DC与T细胞的结合及归巢倾向（但这些表面标志随DC的不同分化阶段而有变化）；④DC具有显著区别于其他细胞的表面标志，活化的DC不表达T细胞、B细胞和单核（或）巨噬细胞的典型表面标志，却表达CD83、SI00、CD40、CD80、CD86、CD1a、CD11c、CD45、HLA?A/B/C和HLA?DR、HLA?DQ等。
1.2 DC具有异质性 有人将DC分为髓系（myeloid）、淋巴系（lymphoid）和类浆样细胞（plasmacytoid cells）三大类，但目前对其分类仍存争议［4-6］。Banchereau［7］强调了DC异质性的几个基本观点：①不同DC分化亚群有着某些共同的生物学功能，并且各自展现出独特的一面，例如通过1型或者2型应答来调节T细胞的极化、调节B细胞的应答；②功能特异性的DC与自身的分化成熟分期相关，包括：在前体细胞期可以分泌大量的炎症前介质和（或）抗病毒细胞因子，在未成熟期具有强大的抗原捕获能力，在成熟期可以活化和调节T细胞应答；③髓系DC对T细胞免疫反应可产生强烈的刺激作用，并可分泌IL?12，调节T细胞和NK细胞功能，促进Th0朝Th1方向分化，显著影响Th1和Th2的平衡。淋巴系DC倾向于促进Th2分化，并可递呈源自凋亡细胞的肽片段。
1.3 DC对B细胞的生长和免疫球蛋白的分泌有重要作用 两者虽同为APC，但DC高表达MHC及共刺激因子，能大量产生IL?12；DC通过Fc及多聚凝集素（multilectin）受体中和抗原，B细胞则有抗原特异性免疫球蛋白受体。幼稚B细胞仅与间质内非郎罕型DC反应，在DC分泌的IL?12作用下产生抗体；DC同时调控着B细胞所产生的免疫球蛋白的种类，IL?10与转化生长因子?β（transforming growth factor ?β, TGF?β）诱导IgA1的生成，IgA2的表达则严格依赖于B细胞与DC的直接相互作用，这说明DC控制着粘膜免疫［7］。滤泡型DC直接维持激活B细胞的活力、生长与分化，生发中心含有CD11c+ DC，它可携带免疫复合物，有较强的刺激B细胞的能力。
1.4 DC的体外诱生 体外诱生DC有许多不同的方案，视组织来源而定，应用不同的细胞因子进行诱导培养，而不同的细胞因子发挥着不同的作用：GM?CSF可诱导DC前体扩增，促使其分化，并可在体外维持DC存活达6周；IL?4往往与GM?CSF同时使用，特别是将外周血单核细胞作为前体时，IL?4可抑制巨噬细胞克隆形成，诱导DC生长和成熟；当用骨髓或脐血CD34+细胞作前体时，则用TNF?α代替IL?4，因为TNF?α可降低粒细胞的产生，上调细胞GM?CSF β链的表达，增强其对细胞因子信号的反应能力［6］。先用GM?CSF、TNF?α和IL?4刺激的骨髓CD34+细胞培养体系中加入Flt3配体可使DC的收获率提高5倍，再加入SCF可进一步提高得率［8］。不同的前体细胞、细胞因子和培养条件可以改变DC的表型和功能。GM?CSF和IL?4有利于髓系DC分化，而IL?3促进向淋巴系DC分化，CD40L则对两种DC的成熟都有促进作用。
2 导致HBV慢性感染的可能因素
HBV感染慢性化的机制非常复杂，目前认为HBV诱导机体产生免疫耐受是导致持续感染的主要原因，并与几个重要因素相关：①虽然在慢性HBV携带者中能检测到病毒特异性免疫反应，但是抗病毒免疫反应的强度在质和量上都不足以完全清除病毒感染细胞；②慢性HBV携带者的肝脏微环境可能不适于病毒特异性淋巴细胞正常功能的执行，与渗入组织中成熟活化的DC不能产生足够的细胞因子有关；③HBV感染除肝脏以外的其他组织和细胞（淋巴样或非淋巴样），可能逃避抗原特异性淋巴细胞的正常免疫监视，其肝外感染细胞可能作为病毒的持续性庇护所［9］。关于HBV感染的外周血单个核细胞(PBMC)已有报道，据此，DC也可能被病毒感染，病毒感染的DC在诱导免疫反应中的作用有待进一步研究。
3 DC与HBV慢性感染的可能机制
3.1 DC在HBV清除过程中的作用 正常情况下，机体通过天然免疫和特异性体液免疫应答清除血液循环中的HBV，通过特异性细胞免疫应答清除肝细胞内的HBV。HBV抗原被DC等抗原呈递细胞摄取后，处理成不同长度的多肽，其中Ⅰ类多肽与主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHC?Ⅰ）分子结合并被呈递给CD8+ T细胞，Ⅱ类多肽与MHC?Ⅱ类分子结合并被呈递给CD4+T细胞。这些能够被MHC分子呈递的多肽即为“表位”。特异性细胞毒性CD8+ T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）是清除肝细胞内HBV的主导力量，既能通过释放IFN?γ和TNF?α等细胞因子抑制或清除肝细胞内的HBV，又能通过特异性细胞毒作用直接杀伤靶细胞，以便清除细胞内的HBV；CD4+T细胞可调节CD8+T细胞的活性，也能释放IFN?γ和TNF?α等细胞因子而有助于肝细胞内HBV的清除［10,11］。抗原提呈是机体免疫识别“异己”的关键步骤，因此DC成为了免疫识别的前哨。
3.2 DC的功能缺陷和表型不成熟 体外研究发现，慢性HBV感染者和健康者外周血DC均表现出成熟DC的典型形态，但HBV感染患者DC的增殖能力和细胞数明显低于健康者［12］。患者DC在异源性混合淋巴细胞反应中的刺激能力和IL?12的生成明显降低，但NO的生成明显升高。
也有研究者对来自慢性乙型肝炎患者的DC进行体外培养，发现正常DC呈现出多个突起，与周围及远处的细胞交联成网状，且数量较多；而慢性乙肝患者的DC虽也呈簇状，但突起较少，数量也较少，反映了慢性乙型肝炎患者DC变形能力较差，且存在着成熟障碍［13,14］。当机体受到感染时，未成熟DC不断分化成熟，成熟的DC吞噬和增殖能力下降，而移动和抗原提呈能力增强，其功能由摄取抗原转向加工处理、提呈抗原给T细胞，直接激活初始T细胞，诱导T细胞特异性免疫应答。因此，慢性HBV 感染者外周血DC功能缺陷和表型不成熟，可能导致DC不能有效递呈HBV抗原。
3.3 DC的表面分子表达下降 DC的表面分子独特，可作为鉴定DC的类型和分化阶段的标志，同时具有重要的免疫学作用，其中最为主要的是提供T/B细胞活化的第二信号。为进一步探讨DC表面CD1a抗原的表达水平与慢性HBV感染的体液反应的关系，学者们对HBV转基因鼠（HBV?TGM）的研究发现，TGM的DC表面CD1a和CD86表达是降低的，IFN?γ处理可使其上调，认为CD1a抗原表达水平是发挥其抗原递呈能力的关键因素［15,16］。对慢性HBV感染者的研究也发现，感染者外周血DC表面的CD1a、HLA?DR、CD80和CD86的表达水平低于健康者［17］。在体外以HBsAg或细胞因子负载慢性乙型肝炎患者外周血DC后检测其功能和表型，发现经抗原刺激的DC可以使淋巴细胞的增殖能力得到恢复，而DC的表面标志物的表达上调［18，19］，为肿瘤或慢性感染性疾病的免疫治疗提供了实验依据，治疗性DC疫苗的研究也由此而来。
3.4 DC对Th细胞的分化影响 辅助性T细胞（T helper cell, Th）可分为Th1和Th2两型，选择性激活Th1或Th2是许多免疫应答的关键所在。Th1和Th2由Th0细胞分化而来，DC将抗原提呈给未受抗原刺激的Th0细胞，同时分泌细胞因子，调节Th0分化成Th1或Th2细胞。Amsen等［20］最近研究发现DC表面凹槽可以影响Th1和Th2的分化。大量研究表明，Th0细胞向Th1细胞分化的关键因素是IL?12。DC产生IL?12的量决定其诱导Th的分化方向，通常大量的IL?12诱导Th1分化，量少时诱导Th2分化。通过外源性IL?12可以使慢性HBV感染者自体DC诱导的Th细胞减少得以恢复，Th1细胞在病毒清除方面的重要性已经在慢性HBV感染者和动物模型上得到确认［21，22］。IL?4是Th0细胞向Th2细胞分化的主要因子，却并非由DC直接产生，但DC可促进未成熟T细胞、嗜酸性细胞或杀伤细胞产生IL?4［23］。也就是说，DC对Th细胞的分化，同样影响着机体对HBV的清除。
4 研究前沿及展望
免疫学的研究进展对慢性HBV感染发病机制的研究指出了新的方向：①在控制HBV复制和基因表达中细胞因子的关键作用；②慢性HBV携带者免疫缺陷的机制；③APC，尤其是抗原递呈性DC在持续HBV感染中的重要作用。由于人类慢性HBV感染携带者肝组织样本难以获得，所以研究人类肝脏DC的特性较困难。因此，许多学者试图通过对HBV转基因鼠模型或体外HBV转染DC的研究来评价DC在人慢性HBV携带状态发病机制中的作用。虽然目前的实验数据显示了慢性HBV携带者DC的功能降低，但是从已经构建的慢性HBV携带者的动物模型中DC的描述，还不能对DC在慢性HBV携带状态发病机制中的作用得出一个成熟的结论。毕竟动物模型和体外HBV转染DC的研究结果与慢性HBV感染患者体内DC的真实功能状态还存在一定的差异性，尚有待进一步深入研究。
【】
1 Steinman RM，Cohn ZA. Pillars Article: Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med，1973，137:1142?1162.
2 Romani N, Gruner S，Brang D, et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med，1994, 180（1）：83?93.
3 Steinman RM. Dendritic cells and immune?based therapies. Exp Hematol，1996,24（8）: 859?862.
4 Steinman RM, Banchereau J. Taking dendritic cells into medicine. Nature, 2007, 449（7161）: 419?426.
5 MacDonald KP, Munster DJ, Clark GJ,et al. Characterization of human blood dendritic cell subsets. Blood, 2002, 100(13): 4512?4520.
6 Ardavín C, Martínez del Hoyo G, Martín P, et al. Origin and differentiation of dendritic cells. Trends Immunol, 2001, 22(12): 691?700.
7 Banchereau J, Briere F, Caux C, et al. Immunobiology of dendritic cells. Ann Rev Immunol,2000,18(3):767?811.
8 Brasel K, De Smedt T, Smith JL，et al. Generation of murine dendritic cells from flt3?ligand?supplemented bone marrow cultures. Blood, 2000, 96（9）: 3029?3039.
9 骆抗先，主编．乙型肝炎基础和临床．第3版．人民卫生出版社, 2006．151?164．
10 Ganem D，Prince AM．Hepatitis B virus infection?natural history and clinical consequences．N Engl J Med，2004，350（11）：1118?1129．
11 Bertoletti A，Chisari FV，Penna A，et al．Definition of a minimal optimal cytotoxic T?cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein．J Virol，1993，67（4）：2376?2380．
12 Duan XZ, Zhuang H,Wang M, et al. Decreased numbers and impaired function of circulating dendritic cell subsets in patients with chronic hepatitis B infection (R2). J Gastroenterol Hepatol，2005,20(2) ：234?242.
13 Zheng BJ, Zhou J, Qu D, et al. Selective functional deficit in dendritic cell?T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection. J Viral Hepat，2004,11（3）,217?224.
14 van der Molen RG, Sprengers D, Binda RS，et al. Functional impairment of myeloid and plasmacytoid dendritic cells of patients with chronic hepatitis B. Hepatology，2004,40（3）: 738?746.
15 Akbar SM, Inaba K, Onji M. Upregulation of MHC class II antigen on dendritic cells from hepatitis B virus transgenic mice by interferon?gamma: abrogation of immune response defect to a T?cell?dependent antigen. Immunology, 1996, 87 (4):519?527.
16 Krose K, Akbar SM, Yamamoto K, et al. Production of antibody to hepatitis B surface antigen (anti?HBs) by murine hepatitis B virus carriers: neonatal tolerance versus antigen presentation by dendritic cells. Immunology，1997，92(4):494?500.
17 Untergasser A, Zedler U, Langenkamp A, et al. Dendritic cells take up viral antigens but do not support the early steps of hepatitis B virus infection. Hepatology, 2006，43（3）:539?547.
18 Chen M, Li YG, Zhang DZ, et al. Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B: a clinical study. World J Gastroenterol，2005，11(12):1806?1808.
19 Furukawa S, Akbar SM, Hasebe A, et al. Induction and maintenance of anti?HBs in immunosuppressed murine hepatitis B virus carriers by a novel vaccination approach: implications for use in hepatitis B virus?infected subjects with liver transplantation. J Gastroenterol，2004，39（9）:851?858.
20 Amsen D, Blander JM, Lee GR, et al. Instruction of distinct CD4 T helper cell fates by different notch ligands on antigen?presenting cells. Cell,2004,117(4):515?526．
21 Trinchieri G. Interleukin?12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nat Rev Immunol,2003,3(2):133?146.
22 Beckebaum S, Cicinnati VR, Zhang X, et al. Hepatitis B virus?induced defect of monocyte?derived dendritic cells leads to impaired T helper type 1 response in vitro: mechanisms for viral immune escape. Immunology, 2003, 109(4): 487?495.
23 Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998, 392（6673）: 245?252.
