尘螨变应原Derf2基因克隆及序列分析

            作者：崔玉宝,周鹏,彭明,周鹰,彭江龙  

【摘要】  　　目的: 获得尘螨变应原Der f 2基因及其生物信息学资料. 方法: 提取粉尘螨总RNA，RT?PCR合成Der f 2的cDNA片段，回收PCR产物并连接至pMD19?T simple，经测序验证后亚克隆入表达载体pET?28a (+)，转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒，双酶切鉴定. 用ExPaSy, EBI, NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析. 结果: RT?PCR扩增获得了Der f 2 cDNA片段，酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功. 与序列相比，测序结果多了87 bp (77~163)，但Blastn发现广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87 bp. 同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示，该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近. 推测该变应原由176个氨基酸组成，与附睾分泌蛋白E1具有同源性，信号肽位于1~17aa处，在6~24aa处有一跨膜螺旋. 二级结构由a?螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成. 结论: 获得了粉尘螨变应原Der f 2编码基因及其分子特征，为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.

【关键词】  粉尘螨；Der f2基因；克隆；变应原；生物信息学

　　Clone and sequence analysis of a major allergen Der f 2 from house dust mites

    【Abstract】 AIM: To characterize the group 2 allergen of the house dust mite Dermatophagoides farinae from Hainan Island, a tropical region in Southeastern China. METHODS: After the total RNA of D. farinae was isolated, cDNA encoding the group 2 allergen was synthesized by RT?PCR, and the PCR products were inserted into the vector pMD19?T simple, which were subcloned into pET?28a(+) and transformed into E.coli and identified with restriction enzyme analysis. Subsequently the sequencing result was analyzed by software in ExPaSy, EBI and NCBI web. RESULTS: The cDNA coding for Der f 2 was cloned and sequenced successfully, and we found an additional region of 87 bp (from 77 to 163 bp) in our strain but it was absent in reference sequence (GenBank AB195580). By Blastn analysis, the same additional nucleotides were found in the strains reported from Reinbek, Germany and Guangzhou, China. A polygenetic tree, constructed using the nucleotides sequences coding for Der f 2 reported from different regions or countries showed that our sequence was clustered with the strains from Reinbek and Guangzhou. Analysis of the translated amino acid sequence suggested that the encoded peptide was hydrophobic and extracellular with a cleavage site between 17aa and 18aa and a strong transmembrane helices from 6aa to 24 aa, indicating a MD?2?related lipid recognition domain. The secondary structure of the pro?protein consisted of 16.57% alpha helix, 32.57% extended strand and 50.86% random coil. CONCLUSION: We have obtained a gene coding for Der f 2 and this gene shows significant difference with those reported previously. We can predict the molecular characteristics of this protein using bioinformatic tools.

    【Keywords】 dermatophagoides farinae; Der f 2; clone; allergen; bioinformatics

　　0引言

    尘螨排泄物、代谢物及螨体具有较强的变应原性，可引起过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎等变态反应性疾病. 尘螨粗提浸液中至少有30余种成份可诱导特应性体质产生特异性IgE，据报道约80%以上的哮喘患者血清螨特异性IgE是直接针对尘螨Ⅱ类变应原［1］. 免疫被认为是变态反应性疾病唯一的病因治疗方法，可以改变病程，阻滞症状的恶化和防治对新的变应原产生过敏［2-4］. 免疫治疗的关键是获得高纯度的变应原制品，我们对尘螨Der f 2进行基因克隆并探讨其分子生物学特征，为进一步研制基因工程变应原免疫治疗尘螨源变态反性疾病奠定基础.

    1材料和方法

    1.1材料BamH I酶、Xho I酶、Takara RNAiso Reagent（Code No.D312）, 3′?Full RACE Core Set Ver. 2.0 (Code No.D314), Takara LA Taq? with GC Buffer DNA Polymerase (Code No. DRR02AG), Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805), Takara DNA Ligation Kit (Code No. D6023), pMD19?T simple （Code No. D104）, E.coli Competent Cells JM109 （Code No. D9052）均购自TaKaRa公司；pET28a (+) (Kit Lot No. N72770)由Novagen公司生产，其它试剂为国产分析纯. TP3000 PCR仪（Takara Bio Inc.），Mupid电泳仪(Advance?Bio Co., Ltd)，ImageMaster? VDS电泳成像装置（Pharmacia Biotech），ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer DNA测序仪（Perkin Elmer）.

    1.2方法根据GenBank (AB195580)公布的Der f 2基因序列设计引物，并加入BamH I/Xho I酶切位点，由宝生物工程(大连)有限公司合成如下：上游引物F：5′ GGATCCATGATTTCCAAAATCTTGTGCCTTTC 3′；下游引物R：5′ CTCGAGTTAATCACGGATTTTACCATGGG 3′. 解剖镜下挑取粉尘螨约600只，匀浆后用Takara RNAiso Reagent试剂盒提取Total RNA，操作按说明书进行.

    1.2.1扩增Der f 2的cDNA片断以Total RNA为模板，使用3′?Full RACE Core Set Ver.2.0，进行RT合成cDNA，反应体系为：Total RNA 3 mL, 10×RNA PCR Buffer 1 mL, 各10 mmol/L dNTP Mixture 1 mL, 25 mmol/L MgCl2 2 mL, 83 mkat/L M?MLV Reverse Transcriptase XL 0.25 mL, 667 mkat/mL RNase Inhibitor  0.25 mL, 20 μmol/L下游引物R 0.5 mL, Random 1 mL, DEPC H2O 1 mL. 反应条件：42℃ 30 min RT, 99℃变性5 min. 反转录后进行PCR扩增，反应体系为：RT产物2 mL, 2×GC Buffer (5 mmol/L Mg2+ Plus) 25 mL, 83 mkat/L LA Taq 0.5 mL, 1×cDNA dilution Buffer 8 mL, 上游引物F 1 mL,下游引物R 1 mL, dH2O 12.5 mL, 反应条件94℃ 3 min变性，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min条件下进行30个循环，72℃ 5 min延伸. 取产物5 mL在含溴化乙锭的10 g/L琼脂糖凝胶电泳，用ImageMaster? VDS电泳成像装置观察结果并拍照.

    1.2.2重组质粒构建及酶切鉴定使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收上述PCR产物、DNA Ligation Kit将回收产物与pMD19?T simple连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板37℃过夜培养. 蓝白斑筛选，挑选白色菌落扩增培养，碱裂解法提取质粒，用BamH I和Xho I酶切鉴定.

    1.2.3克隆载体构建及鉴定使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收上述PCR产物、DNA Ligation Kit将回收产物与pMD19?T simple连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布于含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB平板上，37℃培养过夜. 从含氨苄青霉素的LB平板上随机挑取16个白色菌落，利用载体上的引物进行PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳，含有目的条带的菌落为阳性克隆菌. 取阳性克隆菌置于含氨苄青霉素的TB培养液中，37℃振摇培养过夜. 取重组阳性克隆，提取质粒DNA，用BamH I和Xho I双酶切鉴定pMD19?T?Der f 2重组子. 用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段的大小. 以重组质粒DNA为模板，委托宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定.

    1.2.4亚克隆质粒pET28a(+)?Der f 2的构建及鉴定用BamH I和Xho I分别对阳性质粒及pET 28a(+)载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用Agarose Gel DNA Purification Kit切胶回收，用DNA Ligation Kit将目的基因片段和pET28a(+)连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109，37℃培养过夜. 挑取单个菌落，提取质粒后行琼脂糖凝胶电泳，对目的质粒行BamH I/Xho I双酶切鉴定.

    生物信息学分析：用ExPaSy，EBI，NCBI网站上的在线软件进行.

    2结果

    2.1Der f 2基因克隆及酶切鉴定RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA，经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳见一条约528 bp的条带. PCR产物回收后与pMD19?T simple连接后，转化至E.coli Competent Cells JM109中，过夜培养，蓝白斑筛选并提取质粒，用BamH I和Xho I酶切(图1).

    M1: l?Hind Ⅲ DNA Marker; M2: DNA Marker DL2000; 1,2: BamH I/Xho I双酶切重组质粒pMD 19?T?Der f 2.

    图1重组质粒pMD19?T?Der f 2双酶切鉴定

    2.2亚克隆及鉴定用BamH I/Xho I双酶切pMD19?T?Der f 2质粒，将纯化后的目的基因亚克隆至pET28a(+)载体构建原核表达质粒pET28(a)?Der f 2，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamH I/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带，与预期相符（图2），说明亚克隆获得成功.

    M1: l?Hind Ⅲ DNA Marker; M2: DNA Marker DL2000; 1,2: BamH I/Xho I双酶切质粒pET28(a) ?Der f 2.

    图2亚克隆质粒pET28(a)?Der f 2双酶切鉴定

    2.3测序结果比较将初筛的2个阳性菌通过摇菌、质粒提取并纯化. 使用引物BcaBEST Primer M13?47，BcaBEST Primer RV?M进行测序，去除原始测序结果5′和3′端的酶切位点后，联网到NCBI的ORF finder服务器对此序列进行可读框架分析，结果发现含一个完整的开放读码框，从起始密码子ATG到终止密码子TAA共528 bp. 与序列相比，测序结果多了87 bp (77~163)，两者的同源性为83%（图3）. 将本实验测序结果输入NCBI网站搜索同源序列，结果发现，广州和德国Reinbek公布的Der f 2核酸序列也含有77~163位置的87 bp序列，本文测序结果与中国广州Hao.M等人报道的序列同源性高达100%，相似性为90%，与德国Reinbek地区报道的序列同源性为97.7%，相似性为87%（表1，2）. 不同地区报道的Der f 2核酸序列构建出的分子进化树，提示中国海南和广州地区以及德国Reinbek地区报道的Der f 2亲缘关系较近(图4).表1不同地区报道的Der f 2核酸序列同源性表2不同地区报道的Der f 2核酸序列相似性图4不同地区报道的尘螨变应原Der f 2分子进化树

    2.4氨基酸序列分析由测序结果推测Der f 2由175个氨基酸组成. 该编码蛋白信号肽序列位于1~17氨基酸处，拓朴分析提示其6~24氨基酸处为一跨膜螺旋. InterProscan分析显示该蛋白与附睾分泌蛋白E1具有同源性. 二级结构预测表明其由由a?螺旋(29 aa, 16.57%),延伸链(57 aa, 32.57%)和随机卷曲(89 aa, 50.86%)组成.

    3讨论

    变应原特异性免疫通过小剂量皮下注射尘螨变应原，并逐渐增加变应原剂量，提高患者对尘螨变应原的免疫耐受力，调节患者细胞免疫功能，增强Th1反应、抑制Th2反应，并产生高水平的IgG抗体阻断变应原结合到IgE，是此类疾病唯一的病因治疗方法［2-4］. 目前，国内主要采用变应原粗提浸液用于诊断和治疗，但粗提浸液成分复杂，如存在变应原、非过敏性或毒性蛋白等，很难标准化，长期使用可能导致严重的副作用. 基因工程变应原可弥补此缺点，利用PCR等技术分离获得主要变应原的编码基因将其导入宿主细胞中表达，分离纯化获得的致敏蛋白纯品具有低致敏性、高特异性，可提高临床诊断和治疗和安全性和有效性［5-6］. 因此，探讨基因工程变应原的生产方法、了解变应原基因信息，成为变态反应学研究的主流. 我们根据已公布的Der f 2核酸序列设计引物，从粉尘螨总RNA逆转录获得其编码基因，意外地发现其比参考序列(GenBank AB195580)多了87 bp (77~163). 其后的Blastn比对发现，中国广州和德国Reinbek公布的Der f 2序列里亦含有此87 bp，即AJ862838，AJ862837，AJ862836 和 AF346905，它们和本次报道的核酸序列具有较高的同源性和相似性. 因此，可以排除此87 bp为内含子. 关于Der f 2基因多态性，Yuuki等［7］报道76 bp, 88 bp, 111 bp和125 bp处为多态性位点，本研究中其76 bp后多了长达87 bp的核酸序列，似乎验证了Yuuki等报道. 至于中国海南和广州地区以及德国Reinbek地区报道的Der f 2亲缘关系较近，而与中国深圳等其它地区关系稍远，确切的原因有待进一步的研究.

    长期以来，人们对基因工程技术生产尘螨变应原均集中于其活性部位的研究，但结果表明，其活性部位编码基因表达产物特异性IgE结合力偏低. 有学者认为信号肽序列和酶原序列对变应原的成熟及分泌起着重要的作用，在以基因工程技术生产重组变应原时应以编码基因全序列进行基因表达，如Best等［8］将Der f 1编码基因的全序列导入毕氏酵母(Pichia pastoris)中，该表达产物与特异性IgE的结合力及结合率明显高于Der f 1天然提取物(活性成份). 因此，我们根据已公布的Der f 2全序列，设计引物RT?PCR获得目的基因片段，并将其连接至原核表达质粒pET 28a(+)上，为进一步原核表达该变应原奠定了基础.

【参考】
  ［1］ Thomas WR, Smith WA, Hales BJ. The allergenic specificities of the house dust mite ［J］. Changgung Med J, 2004, 27(8):563-569.

［2］ Norman PS. Immunotherapy: 1999-2004 ［J］. J Allergy Clin Immunol, 2004, 113(6):1013-1023.

［3］ Greenberger PA. Immunotherpy update: Mechanisms of action ［J］. Allergy Asthma Proc, 2002, 23(6):373-376.

［4］ Ramirez NC, Ledford DK. Immunotherapy for allergic asthma ［J］. Med Clin North Am, 2002, 86(5):1091-1112.

［5］ Dinakar C, Portnoy JM. Allergen Immunotherapy in the prevention asthma ［J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004, 4(2):131-136.

［6］ Bousquet J, Lockey RF, Malling HJ. Allergen immunotherapy: Therapeutic vaccines for allergic dieases ［J］. Allergy, 1998, 53(Suppl):1-42.

［7］ Yuuki T, Okumura Y, Ando T, et al. Cloning and sequencing of cDNAs corresponding to mite major allergen Der f Ⅱ［J］. Arerugi, 1990, 39(6):557-561.

［8］ Best EA, Stedman KE, Bozic CM, et al. A recombinant group 1 house dust mite allergen, rDer f 1, with biological activities similar to those of the native allergen ［J］. Protein Expr Purif, 2000, 20(3):462-471.