HIF?1α和survivin在胃癌组织中的表达及与血管生成的关系

【摘要】  目的: 探讨缺氧诱导因子?1α(HIF?1α)和凋亡抑制蛋白survivin在胃癌过程中的意义及其对肿瘤血管生成的影响. 方法: 应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测HIF?1α和survivin在70例胃癌组织、14例癌旁组织和15例正常组织中的表达,并计数CD105标记癌组织的微血管密度（MVD）. 结果: HIF?1α和survivin在胃癌组织中的表达明显高于正常组织及癌旁组织（P＜0.05）；HIF?1α和survivin的表达均与胃癌的浸润深度、临床分期及局部淋巴结转移之间存在相关性（P<0.05）；HIF?1α和survivin表达阳性组的MVD均高于各自的阴性组（P<0.05）；HIF?1α 和survivin在胃癌中表达存在正相关性（r=0.285,P<0.05）. 结论： HIF?1α和survivin在胃癌的发展和转移过程中具有重要意义；联合检测两者的表达可用于评价胃癌的恶性生物学行为.

【关键词】  胃肿瘤 缺氧诱导因子?1α survivin CD105

　　0引言

　　多数肿瘤的生长具有缺氧的微环境,肿瘤形成的关键步骤就是对缺氧的适应, 缺氧诱导因子?1α（hypoxia inducible factor?1 alpha，HIF?1α）是细胞适应缺氧而产生的一种核转录因子. 在多种恶性肿瘤如肠癌、乳腺癌、肺癌等组织中，HIF?1α均有过度表达并参与肿瘤血管形成［1］. CD105是一种新型的血管内皮标记物,参与血管生成,在标记肿瘤相关的新生血管内皮上具有更高的特异性［2］. 本实验对70例胃癌、14例癌旁组织、15例正常组织中的HIF?1α、凋亡抑制基因及CD105标记的癌组织的微血管密度（MVD）进行了检测，旨在探讨胃癌发生发展过程中因缺氧而造成的HIF?1α的表达以及其对肿瘤血管形成的影响，为临床新靶点提供依据.

　　1材料和方法

　　1．1材料兰州大学第一附属2003/2005外科手术切除胃腺癌石蜡包埋标本70（男39,女31）例,年龄26～74（平均55.6）岁. 其中高分化21例，中分化30例，低分化19例. 浸润程度:粘膜层18例，肌层33例,达浆膜层19例. 淋巴结转移31例，未转移的39例. 另取该组胃腺癌病例中肿瘤手术切除标本切缘处正常胃粘膜(病理证实)石蜡包埋标本15例及癌旁粘膜14例作为对照. 浓缩型兔抗人HIF?1α多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司,工作浓度为1∶150；即用型survivin和CD105鼠抗人单克隆抗体及SP试剂盒均购自北京中杉公司.

　　1.2方法

　　1.2.1染色方法已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作空白对照. 福尔马林固定胃腺癌标本，石蜡切片58℃烤4 h，常规脱蜡至水，抗原修复（98℃）20 min，PBS洗3×3 min.3 mL/L H2O2抑制内源性过氧化物酶，室温20 min，PBS洗3×3 min，滴加二抗正常血清，室温孵育10 min，不洗切片分别滴加浓缩型兔抗人HIF?1α多克隆抗体(1∶150）、即用型survivin和CD105鼠抗人单克隆抗体于温盒内37℃,1 h，PBS洗3×3 min，滴加二抗，温盒内37℃，10 min，PBS洗3×3 min，DAB显色8～10 min，自来水终止反应，苏木精衬染60 s，水洗蓝化，常规脱水树胶封片.

　　1.2.2结果判断HIF?1α，survivin阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，采用二级计分法，即以染色强度与阳性细胞的百分比的乘积做为半定量标准：染色强度：0分为无色；1分为黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色（深浅与背景色相对比）. 阳性细胞所占的百分比：阳性细胞≤10%为1分；10%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分. 染色强度与阳性细胞所占的百分比的乘积0～3分为阴性（-）；>3分为免疫反应阳性（+）［3］.

　　1.2.3MVD计数以CD105为血管标记物的MVD计数参照Weidner 等［4］的标准,略改动. 在低倍镜下(100×)寻找整张切片中富含血管组织的“热点”(hot spot) 区,即棕黄染色密度最高的区域. 在高倍镜下(400×)计数其内的血管数目,每张切片上分别选择3 个不同高倍视野计数,结果取其平均值.

　　统计学处理: 应用SPSS11.0版本统计学软件对结果进行分析. 两样本均数比较行t检验，计数资料比较用χ2检验，以P≤0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1HIF?1α和survivin的表达HIF?1α和survivin染色的阳性细胞在组织中呈弥漫和(或)散在分布，HIF?1α着色部位主要在肿瘤细胞的细胞核或细胞质. survivin定位于肿瘤细胞的细胞质.15例正常组织中HIF?1α和survivin均无表达；HIF?1α和survivin在14例癌旁组织中阳性表达率分别为21%（3/14）和29%(4/14)；在70例胃癌组织中的阳性表达率分别为61%(43/70)和68%(48/70). 两者在正常、癌旁、癌组织中的表达呈升高趋势，且癌组织与癌旁组织比较，癌组织与正常组织比较，其差异性均有统计学意义（P＜0.05）.

　　2.2HIF?1α和survivin表达阳性与胃癌临床病理参数的关系HIF?1α和survivin的阳性表达率与年龄、性别、肿瘤的分化程度均无明显关系（均P>0.05）. HIF?1α和survivin的表达均与胃癌的浸润深度、临床分期以及局部淋巴结转移之间存在相关性（P＜0.05,表1）. 表1胃癌临床病理参数与HIF?1α和survivin阳性表达间的关系［n(略)］

　　2.3HIF?1α与survivin蛋白表达的关系51例胃癌中HIF?1α和survivin蛋白共同表达阳性者34例，共阴性者13例，HIF?1α表达阳性而survivin表达阴性者9例，HIF?1α表达阴性而survivin表达阳性者14例. 二者总符合率为92%，二者检出情况无显著差异（P>0.05）. spearman等级相关系数r＝0.285，P＝0.017，二者呈正相关性.

　　2.4CD105标记的MVD间的关系CD105所标记的新生血管分布不均匀,大多局限于肿瘤实质的边缘(图1). 新生血管呈点、线、簇状结构,有管腔样结构形成,腔不规则,壁薄无平滑肌形成,癌旁正常组织的血管内皮大多呈阴性,极少数血管呈微弱的阳性.70 例胃癌组织HIF?1α或survivin 表达阳性组的MVD 值显著高于HIF?1α或survivin 表达阴性组，其差异均有统计学意义［(15.6±3.6) vs(13.4±2.8),(15.9±4.2) vs(13.7±2.9),P<0.05］.

　　3讨论
 
　　HIF?1缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体细胞中,由HIF?1α和H IF?1β构成异二聚体,其中HIF?1α是主要的氧调节亚基. HIF?1α具有广泛的靶基因谱，可启动多种基因的转录，其功能涉及到肿瘤血管生成，细胞增殖与凋亡调控、糖代谢、浸润转移等多方面，在肿瘤中起着重要作用［5］. 本结果显示，HIF?1α在癌组织中的表达明显高于癌旁和正常组织，其表达与肿瘤的浸润深度、临床分期以及淋巴结转移之间有相关性，这也说明HIF?1α高表达的肿瘤组织具有较强的浸润转移能力. Survivin作为凋亡抑制蛋白,在多数肿瘤组织中高表达,除抑制凋亡和保护细胞存活外,还参与肿瘤血管形成,对肿瘤的浸润、转移、耐药和放疗抗拒有作用［6］. 本研究显示，survivin蛋白在胃癌中阳性表达率为68.5%,高于癌旁组织，而在正常粘膜中未见表达,提示survivin参与了胃癌的发生、发展. survivin在胃癌中的阳性表达与临床分期、淋巴结转移、浸润深度有关,提示其阳性表达为恶性度较高的一个指标. 本研究结果表明,胃癌组织中HIF?1α和survivin蛋白表达呈正相关，提示二者在胃癌的发生发展中发挥协同作用. Yang等［7］研究证实人类肿瘤细胞系在缺氧环境中survivin表达增加，提示HIF?1α可能通过直接诱导survivin表达或间接影响其活性而增强其抗凋亡作用.    血管生成是实体恶性肿瘤生长侵袭中的一个关键过程. 随着肿瘤的不断增大，血供逐渐不足，机体将通过各种因子诱导血管生成. 在以往的研究中,最常用的血管内皮标记物是CD34 或Ⅷ因子,而CD34和Ⅷ因子是一种泛血管内皮细胞标记物,难以将肿瘤中的新生血管与那些早已存在的血管区分开来. 本实验选用的CD105是近年来发现的一种血管标记物，对于激活的或是处于增殖状态的肿瘤组织的小血管内皮细胞染色具有高度敏感性,而对大血管内皮细胞着色并无显著特异性,故用CD105 作为新生血管标记物可以较容易的区分新生血管与原已存在的正常血管. 它在标记肿瘤血管生成状态方面优于CD34、Ⅷ因子等泛内皮细胞标记物［8］. 本研究结果显示，在肿瘤实质边缘区域，CD105标记的MVD表达较多，这些区域一般认为处于缺氧的微环境中，CD105标记的MVD与HIF?1α和survivin的阳性表达显著正相关，表明缺氧和其他因素导致HIF?1α和survivin的高表达可能通过增加肿瘤新生血管的密度使肿瘤组织中血管内皮的表面积扩大，增强了肿瘤进入微循环的趋势，同时使癌细胞获得通过血液转移和侵袭的能力. 因此抗新生血管可能是有效的抗肿瘤治疗方法，准确的估计肿瘤的新生血管密度不仅可以估计病人的预后，而且可以指导临床的治疗.

【】
  　　［1］Talks Kl,Turley H,Gatter KC,et al. The expression and distribution of the hypoxia?inducible factors(HIF)?1 alpha and HIF?2 alpha in normal human tissue,cancers,and tumor?associated macrophages［J］. Am J Pathol,2000,157(2):411-421.

　　［2］Wikstrom P, Lissbrant LF, Stattin P, et al. Endoglin(CD105) is expressed on immature blood vessels and is a marker for survival in prostate cancer［J］. Prostate,2002,51(4):268-275.

　　［3］许良中. 实用肿瘤病理方法学［M］. 上海：上海人民出版社,1997:123-124.

　　［4］Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma［J］. New Engl J Med,1991,324(1):1-8.

　　［5］Mabjeesh NJ, Willard MT, Frederickson CE, et al. Androgens stimulate hypoxia?inducible factor1 activation via autocrine loop of tyrosine kinase receptor/phosphatidylinositol3??kinase/protein kinase B in prostate cancer cells［J］. Clin Cancer Res,2003,9(7)：2416-2425.

　　［6］Zaffaron IN, Pennatim DA, Idonem G. Survivin as a target for new anticancer interventions［J］. J Cell Mol Med,2005,9(2):360-372.

　　［7］Yang L,Cao Z, Li F, et al. Tumor specific gene expression using the survivin promoter is further increased by hypoxia［J］. Gene Ther,2004,11(15):1215-1223.