Phloretin对Aβ25?35诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制

【摘要】  目的: 探讨Aβ25-35（β?amyloid）诱导PC12细胞凋亡过程中氯通道阻断剂Phloretin 的保护作用及其机制. 方法: 采用MTT比色,LDH（lactate dehydrogenase）活力检测、Hoechst33258染色和琼脂糖凝胶电泳比较正常对照组、Aβ25-35损伤组和Aβ25-35+Phloretin组的PC12细胞存活与凋亡；Western Blot印迹检测3组的JNK,P?JNK蛋白表达. 结果: 10 mmol/L Phloretin可明显抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡，提高细胞存活率，减少LDH释放，减少PC12细胞核固缩、碎裂，降低P?JNK蛋白的表达(P<0.01). 结论: 小剂量氯通道阻断剂Phloretin对 Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡具有保护性抑制作用，其机制与下调JNK的磷酸化激活有关.

【关键词】  β淀粉样蛋白 凋亡 JNK phloretin

　　0引言

　　老年斑（SP）是老年性痴呆（又称阿尔茨海默病，AD）患者脑中主要的病理变化之一，β淀粉样蛋白(Aβ)又是AD患者脑组织老年斑中的主要成分［1］，Aβ的多种片段（Aβ1-40,  Aβ1-42，  Aβ25-35）在体内外均能引起神经细胞的凋亡. 凋亡或程序性细胞死亡的一个标志性的形态学改变是细胞皱缩，也称为凋亡性容积减小（AVD）. 容积敏感性外向整流性氯（VSOR CL-）通道在AVD发生过程中发挥重要作用，阻断VSOR CL-通道可以阻止AVD及其后的凋亡事件的发生［2］. 小剂量的Phloretin可相对特异地阻断VSOR Cl- 通道［3］. 我们拟探讨Phloretin对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响及机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　NGF诱导分化过的PC12细胞株（中科院上海细胞生物研究所）. Aβ25-35（Sigma公司）；Phloretin(Alexis公司)；兔抗鼠P?JNK和SAPK／JNK多克隆抗体(Cell Signaling公司)；二抗羊抗兔IgG?HRP, BA1054(博士德生物工程有限公司)；LDH测试盒(南京建成生物工程研究所)；Hoechst33258染料，细胞凋亡?DNA Ladder 抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所).

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养与分组将分化过的PC12细胞用DMEM高糖完全培养基(含100 mL/L小牛血清,青霉素1×105 U/L，链霉素1×105 U/L），在37℃,50 mL/L CO2 饱和湿度的孵箱中培养，2～3 d传代1次. 实验分组：（1）正常对照组,用正常培养液培养细胞；（2）Aβ25-35损伤组，Aβ25-35浓度为40 mmol/L；（3）Aβ25-35＋Phloretin保护剂组，Aβ25-35浓度均为40 mmol/L，Phloretin 浓度分别为3, 5，10，15 mmol/L.

　　1.2.2MTT检测细胞活性细胞接种在96孔板，每孔的培养液均为200 μL，干预24 h后，每孔加5 g/L MTT 20 μL，37℃，50 mL/L CO2 继续培养4 h，然后小心吸弃上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，混匀，测A490 nm值.

　　1.2.3LDH活力测定干预处理24 h后，按照试剂盒说明书进行操作.

　　1.2.4Hoechst染色六孔板培养细胞24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗，40 g/L的多聚甲醛固定4℃，10 min，去固定液，PBS洗2遍，3 min/次，Hoechst染色0.5 mL, 5 min，将孔中的切片取出，置于载玻片上，滴1滴抗淬灭封片液，盖上洁净的盖玻片，尽量避免气泡，显微镜下观察并拍照. 每组细胞随机选取5个视野，分别计数正常细胞数（胞膜完整,着均匀的蓝色），凋亡细胞数（核染亮蓝色,呈均匀的致密斑块或分叶状），镜下计数细胞凋亡率. 相同实验重复5次取检测结果的平均值.

　　1.2.5琼脂糖凝胶电泳DNA抽提方法按试剂盒说明进行，加样后60 V，电泳90～120 min.

　　1.2.6Western Blot 印迹以总JNK蛋白作对照，测定其活化形式P?JNK的表达. 六孔板培养的细胞，用Aβ25-35进行损伤干预,干预时间分成0, 3，6 h，观察蛋白表达量，从而确定蛋白表达时间. 根据结果把细胞分成空白对照组、Aβ损伤组和Aβ25-35＋Phloretin保护剂组. 将细胞在冰上去除培养液，PBS洗1次,每孔加入含PMSF的细胞裂解液50 μL，冰上孵育30 min，刮取细胞移入EP管中，4℃ 12000 g离心5 min， 吸取上清转移入EP管-70℃ 保存. 用细胞蛋白总浓度测定试剂盒测出每个蛋白标本的蛋白质浓度，加入Loading buffer.  配胶，上样，电泳，半干转膜，封闭，一抗孵育过夜，PBST洗膜，加二抗，摇床摇1 h，PBST洗膜，加发光液发光，Quantity One 软件采集分析图像.
 
　　统计学处理：实验数据以x±s表示，用Graphpad software统计软件进行组与组之间单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1Phloretin对Aβ25-35 诱导细胞损伤的保护作用3，5，10，15 mmol/L Phloretin均有保护作用(图1)，与损伤组比较差异均有统计学意义（P<0.01），其中10 mmol/L Phloretin的保护作用最好，确定其为保护浓度.  

　　2.2LDH活力测定对照组（329±19 U/L）与Aβ25-35损伤组（433±41 U/L）比较差异有统计学意义（P<0.01）；Aβ25-35损伤组与Aβ25-35＋Phloretin保护剂组（354±34 U/L）比较差异有统计学意义（P<0.01）；而对照组与Aβ25-35 ＋ Phloretin保护剂组比较差异无统计学意义.

　　2.3Hoechst染色结果对照组凋亡率为（5.4±2.4）%；Aβ25-35损伤组的凋亡率为（43.2±4.3）%，明显高于对照组（P<0.01）；Aβ25-35＋Phloretin10 mmol/L保护剂组凋亡率为（17.9±3.5）%，明显低于损伤组（P<0.01，图2）.
A:对照；B:损伤；C:Aβ25-35＋Phloretin 10 μmol/L保护剂. 箭头示凋亡细胞.

　　2.4琼脂糖凝胶电泳Aβ25-35损伤组可见明显的DNA “梯带”，对照组和保护剂组无DNA “梯带”（图3）.

　　2.5Western Blot 印迹法检测P?JNK表达6 h 蛋白的表达明显增多，与0，3 h 比较，差异均有统计学意义（P<0.01）. 选用6 h作为蛋白表达的时间点，可见保护剂Phloretin 可使Aβ25-35诱导的P?JNK蛋白表达量显著降低，Aβ25-35＋Phloretin 10 μmol/L与Aβ25-35损伤组比较差异有统计学意义（P<0.01，图4，5）.

　　Aβ是脑组织中SP的主要成份，也是形成SP的重要因素. 大量神经病观察、体内外实验和转基因模型研究均表明Aβ具有神经毒作用，而且Aβ引起的神经毒作用似乎是AD发病的共同通路. 目前认为细胞凋亡是Aβ神经毒作用的重要机制之一. AD患者脑神经元的凋亡率比正常人高30~50倍，细胞凋亡是引起AD脑组织中神经元数目减少的重要原因［4-5］. 但至今对调控Aβ诱导神经元凋亡的机制仍不清楚.

　　等张力性细胞皱缩是细胞凋亡形态学改变的主要标志. 凋亡早期发生的张力正常的细胞皱缩被称为AVD. AVD是细胞凋亡生物化学事件的上游调控机制［6］. 目前认为与AVD发生有关的离子机制主要是细胞膜容积调节性钾通道和氯通道的开放，促使细胞内的K+和Cl-外流，导致细胞容积缩小. 多种氯通道阻断剂（DIDS，NPPB，SITS，NFA等）在不同细胞上均显现对凋亡的保护性抑制作用，而且推测VSOR Cl-通道参与了AVD过程［6-8］. 研究发现，小剂量的Phloretin（<100 mmol/L）能选择性阻断VSOR Cl-通道［3］. 于是，我们研究了小剂量Phloretin（10 μmol/L）在Aβ诱导PC12细胞凋亡中的作用. 结果显示，在细胞存活、细胞损伤、以及细胞凋亡的多项指标上，Phloretin具有非常明显的抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡的作用，而且，这种保护性抑制作用的机制可能是通过下调了P?JNK信号转导. 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在神经元凋亡过程中扮演重要角色，特别是凋亡信号调节激酶1（ASK1），它属于MAPKKK家族成员，通过直接磷酸化MAPKKs激活JNK和p38通路. 在氧化应激、TNF、内质网应激及Aβ诱导神经元凋亡过程中，ASK1是重要的信号激酶. 氯通道阻滞剂SITS或细胞内低氯水平能明显下调Jurkat?T细胞的JNK信号转导，从而抑制细胞色素C释放和细胞凋亡，表明JNK?MAPK途径介导氯通道阻断剂的凋亡保护性抑制作用［9］.

　　综上所述，小剂量氯通道阻断剂Phloretin通过下调P?JNK信号转导，实现有效地抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡，进一步支持VSOR Cl- 通道激活是调控细胞凋亡重要的离子机制之一.

【】
  　　［1］陶瑞松. 老年痴呆症(AD)发病的Aβ假说及相关药物研究进展［J］. 安徽学院学报，2007;25（3）：99-101.

　　［2］Okada Y, Maeno E, Shimizu T，et al. Receptor?mediated control of regulatory volume decrease(RVD) and apoptotic volume decrease(AVD)［J］. J Physiol，2001，532(1):3-16.

　　［3］Fan HT, Morishima S, Kida H, et al. Phloretin differentially inhibits volume?sensitive and cyclic AMP?activated, but not Ca- activated, Cl- channels［J］. Br J Pharmacol， 2001，133(7):1096-1106.

　　［4］Yuan J, Yankner BA. Apoptosis in the nervous system［J］. Nature，2000，407(6805):802-809.

　　［5］Takuma K, Yan SS, Stern DM, et al. Mitochondrial dysfunction, endoplasmic reticulum stress, and apoptosis in Alzheimer?s disease［J］. J Pharmacol Sci，2005，97(3):312-316.

　　［6］Maeno E, Ishizaki Y, Kanaseki T, et al. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2000, 97(17):9487-9492.

　　［7］Shimizu T, Numata T, Okada Y. A role of reactive oxygen species in apoptotic activation of volume?sensitive Cl- channel［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(17):6770-6773.

　　［8］Jiao JD, Xu CQ, Yue P, et al. Volume?sensitive outwardly rectifying chloride channels are involved in oxidative stress?induced apoptosis of mesangial cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2006，340(1):277-285.