戊四氮点燃癫痫大鼠学习记忆改变及海马神经颗粒素的表达变化

【摘要】  目的： 探讨戊四氮慢性点燃癫痫对大鼠学习记忆能力的影响及海马神经颗粒素（neurogranin, Ng）的表达变化. 方法: 采用戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）腹腔注射慢性点燃癫痫(chronic epileptic，CEP) 模型，用Morris水迷宫和Y迷宫对大鼠进行学习记忆能力检测,运用反转录多聚酶链反应(RT?PCR)方法和Western Blot方法分别测定大鼠海马Ng mRNA和蛋白的水平变化. 结果: 与对照组比较，慢性癫痫发作组大鼠在水迷宫中的逃避潜伏期［(7.7±1.3) s vs(4.5±1.1) s］延长(P<0.01)，穿越平台次数［(5.7±2.1) vs (9.2±2.2)］减少(P<0.01)，在Y迷宫中的错误反应次数［(12.8±2.5)vs(6.2±3.1)］增多(P<0.05)，并伴有海马Ng mRNA转录水平［(0.53±0.07) vs(0.74±0.04)］下降(P<0.01)和蛋白表达［(0.61±0.17) vs(0.91±0.23)］减少(P<0.05). 结论: 戊四氮慢性点燃癫痫大鼠学习记忆能力受损，海马Ng mRNA转录水平下降和蛋白表达减少可能参与了这一过程.

【关键词】  点燃效应（神经病学） 癫痫 学习 记忆 神经颗粒素

　　0引言

　　癫痫患者除癫痫发作外，常伴有注意力分散、学习记忆能力减退等认知功能受损的表现，极大的影响了患者的生活质量［1］. 癫痫患者的认知功能障碍已成为癫痫防治的重点之一，但其具体机制不明. Ng是一种新发现的、由78个氨基酸组成的一种脑特异性蛋白质. Ng作为钙调蛋白(calmodulin, CaM)的储库及蛋白激酶C(Protein kinase C,  PKC) 的作用底物，在学习记忆、突触可塑性、应激及老龄化等方面均发挥了重要作用. 海马是与学习记忆密切相关的重要脑区. 本研究建立了更加类似临床反复痫性发作的慢性癫痫大鼠模型，观察其学习记忆能力变化和海马Ng的表达情况，以探讨癫痫后学习记忆障碍的分子机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1实验动物清洁级雄性Sprague?Dawley(SD)大鼠,由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2003?1?003，实验起始体质量(200±20) g，12 h光亮/黑暗条件、22℃～25℃环境温度，分笼喂养.

　　1.1.2药品、试剂与仪器PTZ(Sigma公司)，兔抗Ng多克隆抗体(Upstate公司)，羊抗兔IgG荧光抗体(Rockland公司)， BCA蛋白定量试剂盒(Novagen)，Trizol(Invitrogen)，Rt?PCR反转录及扩增试剂(Promega公司)，引物（赛百盛基因技术公司），Western Blot远红外荧光扫描成像系统(Odyssey)，PCR仪(Eppendorf)，凝胶扫描分析系统（Syngene公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组及模型制备经两次交替电刺激Y迷宫试验筛选后获得合格动物64只，随机分为两组：慢性癫痫发作组(chronic epileptic group，CEP）32只，正常对照组(normal control group，NC）32只. CEP组大鼠每日晨8∶00~9∶00腹腔注射PTZ35 mg/kg，连续30 d，每天注射完毕后观察1 h. NC组大鼠给予同等剂量、同等次数的生理盐水. 依据Racine分级标准［2］将大鼠行为分为6级. 完全点燃的标准是获得连续3次Ⅳ级或以上的运动惊厥.

　　1.2.2Morris水迷宫和Y迷宫测定大鼠学习记忆能力实验第31天起行水迷宫和Y迷宫检测. Morris水迷宫实验包括：(1)定位航行实验:实验历时4 d，第一天大鼠在水池内自由游泳2 min，熟悉环境. 以后每天上下午各测试一组次，每组次每只大鼠从四个象限各入水1次，记录逃避潜伏期. 如120 s未找到平台，将大鼠引上平台休息30 s，记录潜伏期为120 s.(2)空间探索实验:用于测试大鼠的空间记忆能力. 定位航行实验完毕的第二天，将平台撤除，选平台相对象限为入水点，记录大鼠在120 s内穿越平台区域的次数及在平台象限的游泳时间.
Y迷宫试验：试验分为两天，第一天为训练阶段，首先将大鼠放入迷宫，适应环境5 min，然后将大鼠放于某一臂作为起步区进行电击，其一次性逃至安全区为正确反应，否则为错误反应. 每次测试间隔30 s，依次重复，直至学会为止. 学会的标准为连续10次电击有9次正确反应. 第二天为保持阶段，不再适应环境5 min，每只大鼠进行30次测试，记录错误反应次数，每次测试大鼠到达安全区所需时间以及全天总反应时间. 全天总反应时间指全天30次测试所需的总时间.

　　1.2.3RT?PCR方法检测大鼠海马Ng mRNA的变化两组大鼠各取8只，迅速分离海马，Trizol提取海马总RNA，测定其浓度及纯度. 每个样品取2 μg RNA反转录合成cDNA，再各取1 μL cDNA进行PCR扩增. 引物序列：Ng上游：5′? CCACATGGCGAGGAAGAAGA?3′，下游：5′? CTCCTGAAGCTGGCTGGTTG ?3′，扩增长度244 bp. β?actin上游：5′ ?GCCATGTACGTAGCCATCCA?3′，下游：5′?GAACCGCTCATTGCCGATAG ?3′，扩增长度为375 bp. 引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成. PCR条件为：95℃ 2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，32个循环，72℃延伸5 min. 取RT?PCR产物5 μL在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用UVP凝胶成像系统扫描定量电泳条带的灰度，以Ng/β?actin表示产物的相对含量，凝胶图像分析系统分析结果.

　　1.2.4Western Blot方法检测大鼠海马Ng蛋白的变化两组大鼠各取8只，快速分离海马，提取总蛋白. BCA法进行蛋白浓度定量. 取50 μg蛋白95℃ ～98℃变性5 min,然后以120 g/L非连续的Tris?SDS聚丙烯酰凝胶垂直平板电泳，再电转印到硝酸纤维素膜上. 在0.01 mol/L PBS配置的脱脂奶粉中室温封闭1 h，然后与多克隆兔抗Ng抗体(1∶1000)孵育,4℃过夜. TPBS漂洗5×5 min，羊抗兔IgG荧光抗体(1∶3000)中室温孵育1 h, TPBS漂洗5×5 min，Odyssey远红外荧光扫描成像系统扫描并测定目标带单位密度，与β?actin(1∶500,Santa Cruz公司)单位密度值相比后再行统计分析.

　　统计学处理：实验数据以 x±s表示,应用SAS6.12软件进行统计学处理,采用t检验进行组间比较.

　　2结果

　　2.1动物模型制备CEP组大鼠在连续注射第6～10天起开始出现凝视、点头、反复洗脸动作、面部及头部抽搐等，以后发作症状逐日加重,于给药第18～24天全部出现全身肌阵挛、双前肢抬起，最终发生全身强直?阵挛性发作,伴有跌倒、翻滚及流涎,达到RacineⅣ~Ⅴ级的点燃标准,继续给药至30天. NC组动物均无癫痫发作表现.

　　2.2Morris水迷宫及Y迷宫检测

　　2.2.1Morris水迷宫检测定位航行实验：两组大鼠每日上下午逃避潜伏期取其平均值进行比较. CEP组大鼠第1天逃避潜伏期与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05),第2，3 天高于NC组(P<0.01)；空间探索试验：CEP组大鼠120 s内穿越平台区域的次数明显低于NC组(P<0.01),在平台所在象限的游泳时间与NC组比较差异无统计学意义（P>0.05,表1)表1水迷宫实验逃避潜伏期及穿越平台象限次数、平台象限游泳时间的比较 (略)

　　2.2.2Y迷宫检测结果CEP组与NC组比较大鼠的错误反应次数增多（P<0.05)，但全天总反应时间，两组之间比较无显著性差异(P>0.05，表2).表2Y迷宫实验错误反应次数及全天总反应时间的比较 (略)

　　2.3大鼠海马Ng mRNA的表达CEP组大鼠海马Ng mRNA相对吸光度值为0.53±0.07,明显低于NC组(0.74±0.04, P<0.01, 图1)

　　2.4大鼠海马Ng蛋白的表达 CEP组大鼠海马Ng的表达低于NC组［(0.61±0.17) vs (0.91±0.23),P<0.05，图2］.

　　3讨论

　　PTZ是一种GABAA受体拮抗剂，其本身不破坏脑组织结构，无特殊的神经毒性作用，对大鼠的记忆、视力和运动能力无明显影响，常被作为一种化学致痫剂应用于癫痫动物模型的制备［3］. 因此，本实验采用PTZ点燃方法制作的慢性癫痫模型可以作为研究癫痫后认知功能障碍的理想模型.

　　Ng作为一种新发现的脑神经元特异性蛋白质，高表达于与学习记忆密切相关的脑区如前脑皮质、海马区域,且主要分布于锥体神经元的胞体和树突棘中. 在正常生理状态下，Ng与 CaM 形成复合物，当神经颗粒素被磷酸化、氧化及谷胱甘肽化等化学修饰后,与CaM亲和力降低,从而使CaM游离出来与Ca2+结合,进一步参与激活Ca2+?CaM依赖的蛋白激酶系统如CaM依赖性NO合酶(NOS)、CaM依赖性蛋白激酶II(CaMKII)和CaM依赖性腺苷酸环化酶(AC)等的调节，通过广泛的磷酸化作用导致细胞一系列生物学效应［4］. 这些蛋白激酶系统在长时程增强（long?term potentiation，LTP）和长时程抑制(long?term depression，LTD)中发挥重要作用，而LTP和LTD被认为是学习记忆突触可塑性的重要分子机制. Miyakawa［5］ 等研究发现,Ng基因敲除小鼠在健康状态、神经反射、感觉和运动方面表现正常,但在Morris 迷宫任务中,小鼠在隐藏平台实验和在探索实验中不能表现出有选择地搜寻,在Barnes 圆形迷宫(一种空间航向学习任务) 中表现出转向方面的缺陷. Ng基因敲除小鼠在空间学习上表现出缺陷的发现支持Ng在学习和记忆功能上扮演一定的角色.

　　本实验结果显示戊四氮慢性点燃癫痫大鼠的学习记忆能力受损，同时伴有海马Ng mRNA转录水平下降和蛋白表达减少, 推测可能是癫痫导致其学习记忆受损的分子机制之一. 一方面，Ng作为CaM的储库，其表达减少也影响到CaM，使游离的CaM减少进而影响Ca2+?CaM依赖的蛋白激酶系统的活性. 另一方面，癫痫状态下细胞内钙浓度明显增加，存在钙超载现象［6］,钙稳态的失衡导致PKC的活化降低，进而使Ng的磷酸化和去磷酸化失衡，最终影响CaM与Ca2+的结合，而这一方面有待于我们下一步更深入的研究. 总之，Ng作为突触后CaM结合蛋白和PKC的作用底物，参与了在学习记忆功能中起核心作用的脑内几种蛋白信号传导途径和LTP,LTD等突触可塑性机制，也可能作为PKC和CaM的中介物质参与了癫痫导致的学习记忆障碍.

【】
  　　［1］Kwan P, Brodie MJ. Neuropsychological effects of epilepsy and antiepileptic drugs［J］. Lancet,2001,357:216-222.

　　［2］Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II Motor seizure［J］. Electroencephaloqr Clin Neurophysiol,1972,32(3):281-294.

　　［3］Erdogan F,Golgeli A,Arman F,et al. The effects of pentylenetetrazole?induced status epilepticus on behavior,emotional memory,and learning in rats［J］. Epilepsy Behav,2004,5:388-393.

　　［4］Huang KP, Huang FL, Jager T, et al. Neurogranin/RC3 enhances long?term potentiation and learning by promoting calcium?mediatedsignaling［J］. J Neurosci,2004,24:10660.

　　［5］Miyakawa T, Yared E, Pak JH, et al. Neurogranin null mutant mice display performance deficits on spatial learning tasks with anxiety related components［J］. Hippocampus, 2001, 11(6):763-775.