螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用

           作者：李旭，孟莹，张振书，张小兰，黄茂梁  

【摘要】  目的：探讨螺内酯对实验性肝纤维化的影响及其作用机制. 方法: 雄性Wistar大鼠24只，随机分为3组，每组8只. 模型组：CCl4 油2.5 mL/kg SC，3次/wk；螺内酯组：CCl4 油注射的同时每日予以螺内酯20 mg/kg灌胃，1次/d；对照组：橄榄油SC. 于4 wk取材，VG染色检测大鼠肝组织学改变. Western印迹法检测肝组织TGF?β1的表达. EMSA检测肝组织NF?κB的活性. 酶图法测定MMP?2, 9的活性. 另培养大鼠HSC?T6，分别予醛固酮（Aldo） 1 μmol/L、螺内酯1 μmol/L（预处理60 min，再予Aldo刺激1 h）和TNFα 100 μg/L处理1 h，设立阴性对照组. EMSA检测NF?κB DNA结合活性；Western印迹检测胞质内IκBα的表达. 结果: 体内4 wk，螺内酯组纤维化分级小于模型组（螺内酯组vs模型组，P<0.01）；模型组TGF?β1的表达明显高于螺内酯组（模型组vs螺内酯治疗组，P<0.05）. 模型组NF?κB结合活性显著增强（模型组vs对照组，P<0.01），螺内酯可抑制肝组织NF?κB结合活性（螺内酯组vs模型组，P<0.05）. 模型组MMP2,9活性显著增强（模型组vs对照组，P<0.01），螺内酯可抑制MMP2,9活性（螺内酯组vs模型组，P<0.05）. 体外Aldo和TNFα干预1 h后， NF?κB DNA结合活性增强（Aldo处理组vs对照组，P<0.01），螺内酯可抑制NF?κB DNA结合活性（螺内酯+Aldo处理组vs Aldo处理组，P<0.05）. Aldo可减低胞浆内IκBα表达（Aldo处理组vs对照组，P<0.05）. 螺内酯则抑制胞质蛋白中IκBα表达的减低（螺内酯+Aldo处理组vs Aldo处理组，P<0.05）. 结论： 螺内酯可抑制实验性肝纤维化形成，其抗肝纤维化作用与抑制肝组织TGF?β1的表达以及NF?κB和MMP2,9的活性有关.

【关键词】  肾素?血管紧张素?醛固酮系统；螺内酯；核因子?κB；肝硬化

　　【Abstract】 AIM: To determine the effect of spironolactone on the progression of rat hepatic fibrosis in vivo and in vitro and its mechanisms. METHODS: Twenty?four Wistar rats weighing about 250 g were divided into 3 groups, with 8 in each group. In model group, the rats received injection of 40% CCl4 2.5  mL/kg subcutaneously, three times a week. In spironolactone treatment group, the rats received injection of 40% CCl4  as well as ig administration of spironolactone 20 mg/(kg·d). In control group, the rats received injection of olive oil only. After 4 weeks, morphological examination was performed. The expression of TGF?β1 protein in liver tissue was examined by Western Blot. Electrophoretic gel mobility shift assay （EMSA） was utilized to detect NF?κB DNA binding activity in liver tissues. The activities of matrix metalloproteinase?2,9 (MMP?2,9) were assessed by zymography. In vitro, HSC （hepatic stellate cell）?T6 cells were preincubated for 1 h with or without spironolactone 1 μmol/L (an inhibitor of aldosterone) prior to exposure to aldosterone (Aldo) 1 μmol/L for 1 h. DNA binding activity of NF?κB was analyzed by EMSA. The expression of IκBα protein was examined by Western Blot. RESULTS: In vivo, spironolactone treatment significantly reduced mean fibrosis score and protein levels of TGF?β1 in the 4th week (P<0.01, P<0.05). Spironolactone reduced DNA binding activity of NF?κB and MMP?2,9 activities (P<0.01). In vitro, stimulation of HSC by Aldo increased NF?κB DNA binding activity (P<0.01) and decreased IκBα protein expression (P<0.05). On the contrary, spironolactone significantly reduced NF?κB DNA binding activity and increased IκBα protein expression (P<0.05). CONCLUSION: Spironolactone may partly exert inhibiting effects on CCl4?induced hepatic fibrogenesis by reducing TGF?β1 expression, inhibiting DNA binding activity of NF?κB and activities of MMP?2,9. Stimulation of HSC by Aldo promotes NF?κB binding activity which can be inhibited by spironolactone.

　　【Keywords】 renin?angiotensin?aldosterone?system; spironolactone; liver cirrhosis;  NF?κB

　　0引言

　　肝脏肾素?血管紧张素?醛固酮系统（RAAS）的激活与肝纤维化形成密切相关. 肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化的中心环节，HSC可表达醛固酮（Aldo）合成酶基因?CYP11B2，Aldo拮抗剂螺内酯可以抑制实验性肝纤维化形成. 此外，canrenone（Aldo拮抗剂螺内酯的活性代谢产物）可抑制人HSC的增殖和移动［1］. 然而，目前螺内酯抗肝纤维化机制尚未明确. 核因子?κB (NF?κB)负责调控与肝纤维化有关的基因，参与HSC的激活、转化和细胞外基质的合成，Aldo可增强HSC NF?κB DNA结合活性［2］，而螺内酯对HSC NF?κB活性的影响尚不明确，我们探讨螺内酯的抗肝纤维化机制及螺内酯对HSC NF?κB DNA结合活性的作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性SPF级Wistar大鼠（南方医科大学实验动物研究所提供）；HSC?T6细胞株为表型活化的肝星状细胞，由美国Scott L. Friedman先生惠赠. 体外实验用螺内酯、Aldo（Sigma）；TNFα (R＆D公司)；动物实验用螺内酯（广州白云山制药厂）；抗转化生长因子β1（TGF?β1）多抗、抗IKBα多抗（Santa Cruz公司）；蛋白裂解液（CST公司）；ECL化学发光试剂盒（Pharmacia公司）. 核蛋白提取试剂盒（Active Motif公司）. α?P32 dATP(北京亚辉生物医学工程公司)；寡核苷酸探针（上海生工合成）.

　　1.2方法

　　1.2.1体内实验雄性Wistar大鼠24只，随机分为3组. 模型组：400 mL/L CCl4 油（CCl4与橄榄油混合物） 2.5 mL/kg SC，3次/wk；螺内酯治疗组：同法用CCl4 油SC，螺内酯20 mg/kg灌胃，1次/d. 对照组：橄榄油SC. 4 wk宰杀动物，取材. 肝组织标本用中性甲醛固定，石蜡包埋，切片VG染色，观察. 由同一病理专科医师予以纤维化分级. 0级：无胶原纤维形成；1级：汇管区和Disse腔少量胶原纤维形成；2级：胶原纤维显著增生，有形成纤维隔趋势；3级：假小叶形成. 另在液氮中将肝组织碾碎，加入蛋白裂解液500 μL，PMSF 50 μL匀浆，10 000 r/ min，取上清，Bradford法测定总蛋白浓度. 取总蛋白100 μg以120 g/L, 150 g/L SAD?PAGE凝胶电泳分离. 电转移蛋白至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗（TGF?β1多抗，1∶700）于封闭袋中孵育2 h，4℃；二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，1∶2000）孵育1 h. 化学发光法显示结果，压片曝光. 凝胶图象分析系统（UVP公司）检测蛋白质印迹条带灰度. 取新鲜肝组织100 mg，加入1×Hypotonic buffer(含DTT) 3 mL，匀浆，冰浴15 min；4℃ 850 r/min，10 min；弃上清，加入1×Hypotonic buffer重悬，冰浴15 min；加入NP?40 25 μL，震荡10 s；4℃ 14 000 r/min，30 s；收集上清即胞质蛋白，将沉淀重悬于Lysis buffer 100 μL中，震荡10 s；置于摇床中冰浴30 min，150次/min；再次震荡30 s，4℃ 14 000 r/ min，10 min；取上清即为核蛋白，于-70℃保存，测定蛋白质浓度. NF?κB寡核苷酸序列： 5′ AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3′; 5′ AGTTGCCTGGGAAAGTCCCCTC 3′. NF?κB寡核苷酸探针经过聚合、稀释，使其终浓度为10 pmol/L. 加入NF?κB寡核苷酸探针1 μL，加10×Klenow缓冲液2 μL，［α?32P］ dATP 4 μL，无A dNTP (2.5 mmol/L) 3 μL，三蒸水9 μL， Klenow片断1 μL. 总反应体系20 μL，37℃孵育60 min. 经过柱纯化，测定比放射活性. 取5 μg核蛋白上样，采用80 g/L聚丙烯酰胺凝胶， 150 V电泳2 h. 干胶后压片， -70℃冰箱中放射自显影，冲洗胶片. 制备75 g/L的分离胶及40 g/L的浓缩胶，在分离胶中加入2 g/L明胶，蛋白样品50 μg中加入等量的2×蛋白质上样缓冲液(不含二硫苏糖醇). 电泳结束后，将凝胶移入25 mL/L Triton X?100溶液中复性1 h，再在孵育液（50 mmol/L Tris?Cl pH 7.6, 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl2, 0.2 g/L NaN3）中37℃孵育24 h，让明胶酶充分与底物明胶作用. 考马斯亮蓝染色， 脱色液脱色， 至出现清晰的负染条带为止， 干燥凝胶拍照. 阳性结果判断： 考马斯亮蓝染成的蓝色背景下可见到白色条带.

　　1.2.2体外实验DMEM培养液培养HSC?T6细胞，分别予Aldo 1 μmol/L，螺内酯1 μmol/L（预处理60 min，再予Aldo刺激1 h）和TNFα 100 μg/L处理1 h，观察对NF?κB DNA结合活性和IκBα表达的影响，设立阴性对照组. 各组设3个复孔，重复3次实验. 取约8.8×106个HSC?T6细胞，PBS/Phosphatase 5 mL冲洗，收集细胞. 加入1×Hypotonic buffer(含DTT) 3 mL，匀浆，冰浴15 min；4℃ 850 r/min离心10 min；弃上清，加入1×Hypotonic buffer重悬，冰浴15 min；加入NP?40 25 μL，震荡10 s；4℃ 14 000 r/min离心30 s；收集上清即胞浆蛋白，将沉淀重悬于Lysis buffer 100 μL中，震荡10 s；置于摇床中冰浴30 min，150次/min；再次震荡30 s，4℃ 14 000 r/min离心10 min；取上清即为核蛋白，于-70℃保存，测定蛋白质浓度. 聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影同上. 另取胞质蛋白50 μg以120 g/L SAD?PAGE凝胶电泳分离. 电转移蛋白至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭过夜，加入抗IκBα多抗（1∶200）于封闭袋中4℃孵育2 h；二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，1∶4000）孵育1 h. 化学发光法显示结果，压片曝光. 凝胶图象分析系统（英国，UVP公司）检测蛋白质印迹条带灰度.

　　统计学处理:  结果以x±s表示, 肝纤维化分级资料用秩和检验分析. 其余应用SPSS软件进行方差分析及LSD?t检验. P<0.05表示为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1体内实验在实验过程中，模型组大鼠被毛松弛紊乱，毛色暗淡，厌食，消瘦，易怒好斗，死亡2只. 与之相比，螺内酯组大鼠毛色较好，体质量较重，死亡1只. 模型组纤维组织明显增生, 螺内酯组纤维化分级小于模型组（P<0.01，表1，图1A，B）. 模型组TGF?β1的表达强于螺内酯治疗（P<0.05，图2）.表1大鼠实验4 wk肝纤维化分级(略)

　　各组MMP2,9的灰度值与对照组的比值表示酶的活性. MMP2（Mr 72 000）：1, 1.5, 4.0；MMP9（Mr 94 000）：1, 1.4, 3.5. 提示模型组MMP2,9活性增强，螺内酯可抑制MMP2,9活性（图4）.

　　2.2体外实验EMSA检测显示，从泳道2开始，各组NF?κB与对照组的灰度值的比值分别为：1.0, 1.6, 5.5, 10.5. 提示Aldo干预HSC 1 h后， NF?κB DNA结合活性增强.  螺内酯可抑制NF?κB DNA结合活性. TNFα处理后NF?κB DNA结合活性明显增强（图5）.

　　另各组IκBα与对照组的比值表示IκBα的蛋白表达. Aldo和TNFα干预HSC 1 h后，IκBα表达减低. 螺内酯可抑制胞浆蛋白中IκBα表达的减低. 本实验重复3次，得到相似结果（图6）.

　　3讨论

　　Aldo是胶原合成和有丝分裂的强刺激剂. 醛固酮拮抗剂?螺内酯可以抑制心肌［3］的胶原合成. HSC能表达Aldo合成酶基因?CYP11B2，当肝纤维化形成时CYP11B2 mRNA表达上调，肝组织中Aldo水平增高［4］. 螺内酯活性代谢产物canrenone可抑制人HSC的增殖［1］，螺内酯可以抑制实验性肝纤维化形成［2］. 然而其机制尚不明确. 本研究显示，螺内酯治疗4 wk后，大鼠肝纤维化分级低于模型组大鼠. 大鼠肝组织TGF?β1的蛋白表达显著低于模型组大鼠. TGF?β1是公认的促进肝纤维化形成的致纤维化因子. TGF?β1可诱导HSC分泌胶原纤维的合成. 因此，螺内酯对TGF?β1的抑制作用是其抗肝纤维化的重要机制.

　　NF?κB是一族与炎症反应和纤维化密切相关的核因子. 当细胞受到损伤或炎性因子等外界因素刺激时，IκB被磷酸化、泛素化，进而被26S的蛋白酶小体降解，从而解除了对核定位信号的控制，有活性的NF?κB二聚体得以转位到核内，激活下游多种促纤维化形成的靶基因（如TNFα和血管紧张素原等）的转录和表达，促进肝脏炎症损伤和纤维化形成. 新近研究发现，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和Aldo可增强HSC NF?κB活性［2］，ACEI和AT1受体阻断剂可抑制肝组织NF?κB活性［2］. 本研究显示，螺内酯也可抑制肝脏NF?κB结合活性，提示螺内酯的抗肝纤维化作用与其拮抗Aldo进而抑制NF?κB的活性有关.

　　金属蛋白酶?2,9（MMP?2,9）主要降解肝脏Ⅳ,Ⅴ型胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质，对基底膜起破坏作用，与肝纤维化发生的关系极为密切. 有研究发现NF?κB可诱导MMP?2的活性［5］，对MMP2活性的诱导作用可能是NF?κB促进肝纤维化形成的重要机制. 我们发现螺内酯可抑制肝组织MMP?2,9的活性. 提示螺内酯对MMP2,9的抑制作用可能与其对NF?κB的抑制作用有关. 另Aldo干预HSC 1h后， NF?κB DNA结合活性增强，但是强度不及TNFα. 螺内酯可抑制Aldo诱导的NF?κB DNA结合活性. 与此相对应的是，Aldo和TNFα可减低IκBα的表达水平. 螺内酯则抑制胞浆蛋白中IκBα表达的减低. 由于Aldo可诱导蛋白激酶C（PKC）的激活［6］，PKC可激活IκBα激酶，因此Aldo可能通过诱导HSC PKC激活的途径激活IκBα激酶，降解IκBα，解除对核定位信号的控制，使NF?κB活化并发生核转位，行使对靶基因的调控作用，从而促进肝纤维化的形成. 同样也可以解释螺内酯对HSC NF?κB的抑制作用.

　　综上所述，螺内酯可能通过抑制肝脏TGF?β1的合成以及NF?κB和MMP?2，9的活性，从而发挥抗肝纤维化作用. 螺内酯是临床上常用的药物，合理运用无明显毒副作用，将其运用于肝纤维化临床治疗值得进一步研究.

【】
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