麦冬治疗妊娠期糖尿病胰岛素抵抗的作用及机制

                作者：李瑞满，秦佳佳,裴兆辉

【摘要】  目的：观察麦冬妊娠糖尿病胰岛素抵抗的作用，研究其作用机制. 方法：选妊娠10 d大鼠，建立妊娠糖尿病胰岛素抵抗动物模型，正常大鼠为对照组，随机将40只妊娠糖尿病胰岛素抵抗大鼠分为4组（n=10）：GDM组、GDM＋麦冬组、GDM＋罗格列酮和GDM＋罗格列酮+麦冬组. 观察用药前后血糖、胰岛素的变化，检测腹腔脂肪组织中TNF?α与leptin的mRNA表达变化. 结果：与对照组比较，GDM组大鼠空腹及餐后血糖与胰岛素较正常对照组明显升高（P<0.05），TNF?α与leptin的mRNA表达明显增加（P<0.05）；与GDM组比较，麦冬治疗组、罗格列酮治疗组、罗格列酮+麦冬治疗组大鼠空腹及餐后血糖均下降（P<0.05），TNF?α与leptin的mRNA表达明显降低（P<0.05）；与麦冬治疗组比较，罗格列酮治疗组空腹及餐后血糖无明显变化（P>0.05），TNF?α与leptin的mRNA表达无明显变化（P>0.05），罗格列酮+麦冬治疗组空腹及餐后血糖明显下降（P<0.01），TNF?α与leptin的mRNA表达明显降低（P<0.05）；与罗格列酮组比较，罗格列酮+麦冬治疗组空腹及餐后血糖明显下降（P<0.01），TNF?α与leptin的mRNA表达明显变化（P<0.05）. 结论：麦冬治疗妊娠期糖尿病疗效明显，能变胰岛素抵抗状态，其机制与TNF?α与leptin的mRNA表达的变化有关.

【关键词】  中药;麦冬属；妊娠期糖尿病；胰岛素抵抗；肿瘤坏死因子α；瘦素

　　【Abstract】 AIM: To investigate the treatment effect of Chinese herb Maidong on gestational diabetes  mellitus (GDM) and insulin resistance (IR) and to study its underlying mechanism. METHODS: GDM complicated by IR was induced in rats of 10 gestation days. Normal rats served as a control group. Forty model rats were randomized into GDM group, GDM & Maidong group, GDM & rosiglitazone maleate group, GDM, Maidong & rosiglitazone maleate group (n=10). Serum glucose and serum insulin were determined after and before administration. The expressions of TNF?α and leptin were detected in abdominal adipose tissues after and before administration. RESULTS: Compared to controls, serum glucose and serum insulin were evidently increased （P<0.05） and the expressions of TNF?α and leptin also significantly rose （P<0.05） in GDM group. Compared to GDM group, serum glucose and serum insulin were significantly decreased （P<0.05） and the expressions of TNF?α and leptin declined obviously, too （P<0.05） in GDM & Maidong group, GDM & rosiglitazone maleate group, GDM & Maidong & rosiglitazone maleate group. Compared to GDM & Maidong group, serum glucose and serum insulin remained unchanged （P>0.05）and the expressions of TNF?α and leptin were also unchanged （P>0.05） in rosiglitazone maleate group, while serum glucose, and serum insulin （P<0.01） and the expressions of TNF?α and leptin were signicantly reduced （P<0.05） in Maidong & rosiglitazone maleate group. Compared to rosiglitazone maleate group, serum glucose and serum insulin were significantly decreased （P<0.05） and the expressions of TNF?α and leptin were unchanged （P<0.05） in Maidong & rosiglitazone maleate group. CONCLUSION: Treatment effect of Chinese herb Maidong is good for GDM and can reverse IR. These actions are related to the changes of the contents of TNF?α and leptin.

　　【Keywords】 drugs, Chinese herb; ophiopogon; gestational diabetes mellitus (GDM); insulin resistance (IR); TNF?α; leptin

　　0引言

　　随着和生活方式改变，妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)发病率逐渐上升，已经成为威胁母婴健康的严重疾病［1］. 第三届国际妊娠期糖尿病工作会议将GDM定义为妊娠期首次发生或发现的不同程度的糖代谢异常 ［2-3］. GDM对母婴影响较大，使流产增加达15%~30%，妊娠高血压综合征发病率为正常孕妇的3~5倍，羊水过多发病率为13%~36%，巨大胎儿发病率为25%~40%，还会增加孕妇感染、酮症酸中毒及早产、胎儿宫内发育迟缓、围产儿死亡、胎儿畸形等发病率，而且孕妇将来患糖尿病机会增加，大约50%以上最终成为糖尿病患者［4］. 但GDM发病机制仍不清楚. 我们观察中药麦冬在改善胰岛素抵抗（IR）状态中的作用，探讨其防治GDM的机制，为GDM防治提供理论指导及实验证据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　选妊娠10 d大鼠（暨南大学实验动物中心提供），体质量180~220 g. 中药麦冬购于广州中医药大学第一附属，西药罗格列酮购于暨南大学附属华侨医院. 胰岛素放射免疫试剂盒采用北京北方生物技术研究所产品. 肿瘤坏死因子（TNF?α）、瘦素（leptin）及PCR markers引物由华美生物工程公司提供，逆转录酶、Tag酶及缓冲液购自Promega公司.

　　1.2方法

　　1.2.1动物模型建立将上述大鼠高热量饲料(碳水化合物50%,蛋白质13%,动物油脂肪30%,纤维素在内的其他成分7%)喂养8 wk后，给予链脲佐菌素(STZ) 35 mg/kg［STZ用0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠溶液(pH 4.0)稀释成10 mL/L的溶液］一次性尾静脉注射,注射后72 h,测空腹血糖(FBG)稳定在13.5 mmol/L以上者为造模成功.

　　1.2.2胰岛素抵抗评价采用钳夹试验检测大鼠胰岛素敏感性，判断IR模型是否复制成功. 步骤：①插管前大鼠禁食12 h，第2日上午8：00时进行实验，用药大鼠插管前停药24 h，水合氯醛(10 mL／kg)腹腔注射麻醉. 无菌状态下分离暴露大鼠右侧颈静脉和左颈动脉，进行插管，然后取1.5 mL血液进行血浆胰岛素检测. ②将大鼠颈静脉导管接到三通管一端，另二端分别接上输注胰岛素和葡萄糖的输液管,颈动脉导管接一装有肝素生理盐水(5万U／L)的注射器. 先取颈动脉血样测定基础血糖，然后以恒定速度输注胰岛素，每5 min测定血糖一次，当血糖值超出(基础值±0.5)mmol／L的范围时，输注葡萄糖，使血糖值控制在5.5 mmol／L. l h后当连续3次血糖值均在上述范围时，则达到稳定状态. 连续上述过程，直至120 min为止. ③在钳夹期间60~120 min,每隔5 min测定1次,12个GIR值求平均值.

　　1.2.3分组正常大鼠组（对照组），随机将40只妊娠糖尿病胰岛素抵抗大鼠分为4组（n=10）：GDM大鼠组、GDM大鼠＋麦冬组、GDM大鼠＋罗格列酮和GDM大鼠＋罗格列酮+麦冬组.

　　1.2.4给药及标本采集

　　①给药: 治疗组给予麦冬灌胃，0.25 g/(kg·d). 西药对照组给予罗格列酮灌胃，5 mg/(kg·d). 空白对照组及正常对照组均给予同体积的生理盐水灌胃. 正常及空白对照组大鼠以基础饲料喂养. ②标本采集: 从静脉采血后于实验的第12 wk处死动物，并立即取腹腔脂肪组织. 按实验需要制备血清及石蜡切片等.

　　1.2.5标本测定

　　① 大鼠禁食8～10 h后，从后眼眶静脉丛取血，血糖用葡萄糖氧化酶法测定，胰岛素(Ins)以放射免疫法检测. ②动物空腹采血后恢复2～3 d再行葡萄糖?胰岛素耐量实验（G?InsTT）测定大鼠胰岛素敏感性. 大鼠于非空腹状态下，腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠麻醉，行颈外静脉和股动脉插管，先从静脉注射葡萄糖（700 mg/kg），以0.175 U/kg注射普通胰岛素，从股动脉抽血用葡萄糖氧化酶法，测定实验前及注射胰岛素完毕后第3, 6, 9, 12, 15 min的血糖值. 胰岛素敏感性用K值表示，具体方法为：以时间为横坐标，血糖值经自然对数转化后为纵坐标，直线回归所得到的回归系数乘以100即为K值. K值减小表示机体对胰岛素不敏感，即有IR. ③取腹腔冻存的脂肪组织（0.9 g），用TRIzol一步法提取总RNA. 应用RT?PCR法检测脂肪组织中肿瘤坏死因子α(TNF?α)与瘦素(leptin) mRNA表达水平. 引物序列为：TNF?α有义链5′?AGGCGCTCCCCAAAAAGATG?3′，无义链5′?TGGCGGAGAGGAGGCTGACT?3′，扩增产物480 bp；Leptin有义链5′?ACCCCAGCGAGGAAAATGTG?3′，无义链5′?GGAAGGCAAGCTGGTGAGGA?3′，扩增产物288 bp；内参照GAPDH有义链5′?TTCATTGACCTCAACTACATG?3′，无义链5′?GTGGCAGTGATGGCATGGAC?3′，扩增产物443 bp. PCR反应体系为25 μL，其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL, 25 mmol/L MgCl2 1.5 μL, 10 mmol/L dNTPs 0.5 μL, 引物 2 μL, Taq酶2.5 μL, cDNA 2 μL. 循环参数：94℃预变性×1 min，58℃退火×1.5 min，72℃ 2 min，循环35次，最后7次延长至10 min，4℃保存. 取产物10 μL用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，60 V电泳1 h，透射紫外灯下观察结果并拍照. 通过电泳图像分析仪进行灰度测量，基因表达水平用TNF?α和leptin与GAPDH灰度比值表示.

　　统计学处理： 计量数据用x±s表示，组间比较采用方差分析，应用SPSS11.5软件统计数据.

　　2结果

　　2.1血糖的改变GDM大鼠组空腹及餐后血糖较正常对照组升高（P<0.05）；与GDM大鼠比较，麦冬治疗组和罗格列酮治疗组空腹及餐后血糖均下降（P<0.05），罗格列酮+麦冬治疗组空腹及餐后血糖均下降（P<0.01）；与麦冬治疗组比较，罗格列酮治疗组空腹及餐后血糖无明显变化（P>0.05），罗格列酮+麦冬治疗组空腹及餐后血糖下降（P<0.01）；与罗格列酮比较，罗格列酮+麦冬治疗组空腹及餐后血糖下降（P<0.01,表1）.表1各组大鼠血糖的改变（略）

　　2.2胰岛素的改变GDM鼠组空腹胰岛素水平较正常对照组升高（P<0.05）；与GDM大鼠比较，麦冬治疗组和罗格列酮治疗组空腹胰岛素水平均下降（P<0.01），罗格列酮+麦冬治疗组胰岛素水平下降更明显（P<0.01）；与麦冬治疗组比较，罗格列酮治疗组空腹胰岛素水平无明显变化（P>0.05），罗格列酮+麦冬治疗组空腹胰岛素水平下降（P<0.01）；与罗格列酮比较，罗格列酮+麦冬治疗组空腹胰岛素水平下降（P<0.01,表2）.表2各组大鼠血胰岛素水平的改变（略）

　　2.3腹腔内脂肪组织中TNF?α的改变与对照组比较，GDM组TNF?α的表达水平显著升高（P<0.01）；与GDM组比较，麦冬组TNF?α的表达水平降低（P<0.05），格列酮治疗组与罗格列酮+麦冬治疗组TNF?α的表达水平显著降低(P<0.01)；与麦冬治疗组比较，格列酮治疗组和罗格列酮+麦冬治疗组TNF?α的表达水平显著降低(P<0.01,图1).

　　2.4腹腔内脂肪组织中leptin的改变与对照组比较，GDM组leptin的表达水平显著升高（P<0.01）；与GDM组比较，麦冬治疗组leptin的表达水平降低（P<0.05），格列酮治疗组与罗格列酮+麦冬治疗组leptin的表达水平显著降低(P<0.01)；与麦冬治疗组比较，罗格列酮治疗组和罗格列酮+麦冬治疗组leptin的表达水平显著降低(P<0.01,图2).

　　3讨论

　　GDM指妊娠期发生或发现的不同程度葡萄糖耐量异常,若发生在妊娠早期不排除葡萄糖耐量异常在妊娠前就已经存在［5-6］. GDM病因不明. 经典的观点认为孕期胎盘生乳素、催乳素、糖皮质激素、孕激素等拮抗胰岛素激素水平升高，造成胰岛素抵抗状态是主要原因. 近年研究发现GDM的发生除与胰岛素分泌及功能异常有关外,可能还与一些炎症因子、脂肪因子参与.

　　当GDM发生时候常出现IR. IR是指正常浓度胰岛素的生理效应低于正常,为了调节血糖在正常水平,机体代偿性分泌过多胰岛素,即高胰岛素血症［7］. 当B细胞功能无力维持高胰岛素状态时即出现血糖升高,发生糖尿病. 胰岛素抵抗过程中，脂肪细胞产生并分泌TNF?α, leptin等细胞因子，这些因子在IR形成中起重要作用［8］. TNF?α是脂肪组织分泌的多种细胞因子之一，大多数肥胖的啮齿类动物和人脂肪组织TNF?α mRNA表达增加，TNF?α蛋白含量也增加. 胰岛素和leptin之间存在双向调节，一方面胰岛素能刺激脂肪组织产生leptin，另一方面leptin又可直接作用于胰岛B细胞的leptin受体，抑制胰岛素的分泌. 而胰岛素相对或绝对分泌不足是GDM 发病的根本原因，提示GDM时leptin水平可能发生变化［9］.

　　本研究结果表明，GDM大鼠体内存在胰岛素抵抗，一方面血浆胰岛素水平显著升高，另一方面血糖水平也显著升高. 实验证实，与正常对照组比较，GDM组空腹及餐后血糖明显升高，说明GDM组存在胰岛素抵抗. 与GDM组比较，麦冬治疗组和罗格列酮治疗组空腹及餐后血糖均下降，罗格列酮+麦冬治疗组空腹及餐后血糖和胰岛素下降最明显. 实验结果还显示，与正常对照组比较，GDM组TNF?α和leptin的表达水平显著升高. 与GDM组比较，麦冬治疗组和罗格列酮治疗组TNF?α和leptin的表达水平降低，格列酮治疗组与罗格列酮+麦冬治疗组TNF?α和leptin的表达水平降低更显著.

　　TNF?α在中孕、晚孕期显著上升，与IR程度相关. 由此认为TNF?α参与妊娠期IR. 孕期体质量增加及其所致的脂肪增加使TNF?α上升介导了妊娠期IR的发生. 来源于妊娠组织的TNF?α可能是另一种特有的妊娠期致糖尿病因素，在GDM的IR发生中起重要作用. leptin也参与IR的形成. leptin是由肥胖基因编码的一种分泌型蛋白质，主要由白色脂肪组织产生. 白色脂肪组织分泌leptin与体内脂肪含量成正比［10］. 大多数孕妇存在高leptin血症. 本实验GDM大鼠leptin水平显著高于对照组，说明存在着leptin抵抗. leptin抵抗在胰岛素抵抗形成中发挥重要作用. 高脂饮食大鼠leptin增高比胰岛素增高出现得早，高leptin血症参与了胰岛素抵抗的形成和维持［11］. 可见麦冬对GDM大鼠胰岛素抵抗具有明显治疗作用.

　　本实验中,与正常对照组比较，中药麦冬具有明显降低血糖作用，与西药罗格列酮合用效果更好. 由于西药罗格列酮格列酮是过氧化物酶体增殖物活化受体?γ(PPAR?γ)的选择性激活剂，其被激活后调节参与葡萄糖生成、转运、利用，以及脂肪酸代谢有关基因的转录增加胰岛素敏感性；增加外周组织葡萄糖转运蛋白的表达，增加葡萄糖的摄取和转运；改善机体的胰岛素敏感性. 但罗格列酮因肝毒性等副作用，且容易引发IR，严禁在孕期服用. 因此，应用中药麦冬治疗GDM患者具有很好前景［12］. 而且麦冬能够明显降低TNF?α和leptin的表达，故对于GDM大鼠的IR具有明显治疗作用. 单味药如黄连、薏苡仁、葛根、人参、等具有显著的降血糖效果，其降糖作用强度与二甲双胍相似，但抗IR作用较弱. 麦冬不但有降低血糖的作用，而且有改善IR作用较强，增强脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力［1］. 中药疗效稳定，作用温和持久，毒性和不良反应小，在降血糖的同时，对母体及胎儿影响较小.

【】
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