小鼠着床前胚胎miR?125a，miR?295和miR?181b的表达

               作者：张平，杨艳红*，王晓红，王珺，姜峰，罗亚宁，姚元庆

【摘要】  目的： 研究小鼠着床前胚胎发育过程中miRNA表达水平的变化，探讨miRNA对着床前胚胎发育过程的作用. 方法： 建立小鼠超排、交配系统，收集着床前胚胎，提取small RNA；采用miRNA特异RT引物进行反转录，采用SYBR Green实时定量PCR技术，研究miR?125a, miR?295和miR?181b在小鼠着床前胚胎发育过程中表达水平的变化. 结果： 着床前胚胎发育的各阶段均表达miR?125a, miR?295和miR?181b；随着胚胎发育进程，miR?295的表达呈逐渐上升的趋势；miR?125a在卵母细胞到2细胞发育阶段呈下降趋势，以后随发育进程呈逐渐上升趋势. 结论： 小鼠着床前胚胎中表达miRNA，着床前胚胎的发育和分化过程可能受到miRNA的调控.

【关键词】  微RNAs；小鼠；胚胎发育

    0引言

    　　微小RNA（miRNAs）是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码RNA；在个体发育不同时期有不同的表达模式［1］，miRNAs的特定功能与其表达水平高低及其对下游靶基因的调控作用有关，研究特定组织和发育的特定阶段miRNA的时空表达模式，是理解其作用的关键步骤，也是目前分子生物学研究的前沿和热点问题. 本研究采用miRNA特异的RT引物进行反转录，SYBR Green实时定量PCR技术，研究miR?125a，miR?295和miR?181b在小鼠着床前胚胎发育过程中表达水平的变化，探讨了miRNA在哺乳动物着床前胚胎发育过程中的作用.

    1材料和方法

    1.1材料昆白系健康小白鼠，雌雄兼用，购自人民解放军第四军医大学实验动物中心，饲养于本院妇产科动物房，光照、黑暗各12 h；严格控制温、湿度，自由摄食. 昆白系6 wk雌鼠（22~25 g）购回后饲养1 wk，开始实验. 昆白系8~9周龄成年雄鼠购回后单笼单放饲养3～4 d后用于交配，每2 mo更换一批. mir VanaTM miRNA Isolation Kit, 购自Ambion公司. miR?125a，miR?295和miR?181b特异反转录引物和PCR引物以及内参照5S rRNA的引物均购自Ambion公司的mirVanaTM qRT?PCR Primer Set. 定量PCR试剂盒（SYBR Green染料）及Light Cycler 3定量PCR仪为Roche公司产品.

    1.2方法

    1.2.1小鼠着床前胚胎的收集挑选发情前期的雌性小鼠于16:30腹腔注射PMSG（7.5 U/只），注射PMSG 48 h腹腔注射HCG(7.5  U/只)，当晚雌、雄鼠1∶1合笼交配，次日清晨看阴栓. 于交配后0.5, 1.5, 2.5, 4.5 d，分别收集卵母细胞和各发育阶段着床前胚胎［2］放入裂解液，-80℃保存待用.

    1.2.2低分子量RNA的提取采用mir VanaTM miRNA Isolation Kit提取总RNA，采用PEG 6000（购自加拿大BBI公司）分离低分子量RNA. 实验步骤简述如下：解冻-80℃冰箱保存的胚胎裂解液，震荡混匀合并同一发育时期的样品裂解液的体积；加入1/10体积的homogenate additive，上下颠倒混匀，冰上放置10 min；加入与裂解液等体积的Acid?Phenol?Chloroform，剧烈震荡30～60 s，室温静置2~3 min，12 000 g低温离心10 min. 上清移入新的离心管中，加入等体积异丙醇、0.5 μL糖原上下颠倒混匀，室温静置30 min，12 000 g离心10 min；弃上清用750 mL/L乙醇清洗沉淀后室温干燥2~3 min，加入DEPC处理过的去离子水10~15 μL，65℃恒温5 min. 取2 μL样品分光光度计定量，剩余样品补水至总体积为50 μL后再加入等体积的PEG 6000分离低分子量RNA［3］（含miRNA），取20 ng低分子量RNA进行实验.

    1.2.3反转录体系及反应参数取20 ng低分子量RNA，100U M?MLV（购自Invitrogen公司）, 1 μmol/μL  miRNA特异反转录引物，总体系为10 μL反转录合成cDNA. 先将模板、引物与H2O混匀后65℃变性5 min后置冰上，再加入酶、PCR Buffer等试剂，反转录参数为16℃  30 min，37℃  30 min，70℃ 10 min，4℃保存.

    1.2.5荧光定量PCR反应体系及反应参数取2 μL RT产物为模板及miRNA特异性PCR引物1 μL，采用定量PCR试剂盒（SYBR Green染料）及Light Cycler 3定量PCR仪进行PCR扩增，反应体系为20 μL，严格按照试剂盒说明书操作. PCR反应参数：95℃  10 min，1个循环；95℃  15 s，60℃  30 s ，74℃读板，共进行 40个循环.

    1.2.6PCR产物的120 mg/L聚丙烯酰胺凝胶电泳取PCR产物4 μL与2 μL上样缓冲液混匀点样，电泳缓冲液用1×TBE；120 V电泳20 min后90V电泳1.5 h；紫外透射仪下观察，miRNA预期扩增产物大小均为90 bp.

    统计学处理： Real Time PCR反应刚刚进入对数期时，原始模板浓度及体系等差异尚未被放大，扩增的目的片断的量可以近似地看作只与起始模板浓度和扩增效率有关. 根据上述原理采用Microsoft Office Excel对实验数据进行处理，用内参照5S rRNA归一化；最后以待检测的miRNA的Ct值与5S rRNA的Ct值的比值表示［4-5］ miRNA 表达的相对量.

    2结果

    2.1卵母细胞及着床前胚胎中低分子量RNA提取结果收集卵母细胞约6000个、2细胞胚胎约7000个，4～8细胞胚胎约6000个，囊胚约3000个. 提取样品的总RNA采用分光光度计定量，A260 nm/A280 nm值为1.7~2.1，分别得到2~5 μg总RNA；继续分离后分别得到约200~600 ng的低分子量RNA，取20 ng低分子量RNA进行实验.

    2.2qRT?PCR结果miRNA序列短小约22nt，不同的miRNA其RT引物及PCR引物都是针对特定的miRNA序列设计的，反转录引物为类似于miRNA前体的茎环结构. 由于进行反转录引物带有茎环结构以及PCR引物设计只能与miRNA特定序列互补，扩增过程中可能会产生引物二聚体或非特异性扩增产物（图1中5和6泳道）影响定量结果. 因此，首先需要对荧光定量PCR产物进行电泳，miRNA特异扩增产物大小为90 bp. PCR产物经120 mg/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，5S, miR?125a和miR?295均只在90 bp处有特异的扩增条带；miR?181b除了在90 bp处有特异的扩增条带，在卵母细胞和4～8细胞胚胎样品中可见60 bp处的非特异性扩增条带，结果见图1D.

    A：5S rRNA；B：miR?125a；C：miR?295；D：miR?181b； M：20 bp DNA Ladder；1：卵母细胞；2：2细胞胚胎；3：4~8细胞胚胎；4：囊胚；5：无RT产物（有低分子量RNA）对照；6：无RT产物（无低分子量 RNA）对照.

    图1PCR产物120 mg/L聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

    电泳结果表明着床前胚胎发育的各个阶段均表达miR?125a，miR?295和miR?181b，荧光定量PCR 结果可以准确定量miR?125a和miR?295的表达水平. 用5S进行数据的归一化后，用miR?295和miR?125a的Ct值与5S的Ct值的比值进行相对定量，得到miR?295和miR?125a在四个发育阶段的表达水平的变化（表1）；miR?295的表达呈明显逐渐上升的趋势，miR?125a在卵母细胞到2细胞发育阶段呈下降趋势，以后随发育进程呈逐渐上升趋势. 表1miRNA在着床前胚胎中表达水平的比较

    3讨论

    　　miRNA作为基因表达调控的一个重要分子是目前研究热点. 大量的研究表明［6-9］，在小鼠着床后胚胎、小鼠胚胎干细胞、中枢神经系统及内耳的发育等过程均表达miRNA；在斑马鱼、果蝇和鸡的胚胎及人类胚胎干细胞中miRNA的表达模式不同. Krichevskv等［10］的研究还证明哺乳动物脑发育过程与miRNA表达的精确调控有关. 据此可以看出miRNA在胚胎发育、胚层形成和器官分化上起重要作用，并可以预见miRNA在着床前胚胎发育过程中也一定有表达并可能发挥重要的作用. RT?PCR方法是研究miRNA表达最灵敏、可靠的方法. 近年来，设计茎环结构反转录引物进行实时定量PCR（简称looped qRT?PCR）检测miRNA表达的方法初步建立，报道该方法最低检测范围可达到纳克级RNA样品［11］，对于研究miRNA在数量有限的细胞群体（例如原始生殖细胞等）的作用有重要意义.

    　　通过系统查阅文献，我们选择了miR?125a，miR?295和miR?181b三个基因进行研究. miR?295是2003年由Houbaviy等［12］在小鼠的胚胎干细胞中克隆到的一簇miRNA （miR?290～miR?295）中一个，并发现miR?290～miR?295该簇基因仅在干细胞特异性表达而在其他组织中不表达. 小鼠胚胎干细胞来源于小鼠囊胚的内细胞团，据此推测该簇基因可能在小鼠的着床前胚胎发育中起作用. miR?125是Lagos?Quintana等［13］在小鼠脑组织中克隆到的一个与线虫miRNA Lin?4具有高度同源性的miRNA. 线虫Lin?4是第一个发现的miRNA而且与发育关系密切；目前miR?125的靶基因在哺乳动物和果蝇中还未被确认，但是miR?125在果蝇发育过程中的表达具有时序性，仅在果蝇发育到蛹和成虫阶段表达而在胚胎和幼虫发育阶段不表达. 关于miR?181的研究，目前文献报道其主要参与造血细胞的分化过程，特别是与B 淋巴细胞的分化有关［14］. 上述文献都支持miR?125a, miR?295和miR?181b在鼠类和人的细胞发育和分化中起关键作用.

    　　我们通过采用定量PCR方法，发现在小鼠着床前胚胎中均表达miR?125a，miR?295和miR?181b；其中miR?295在8细胞以后发育阶段表达水平明显升高；miR?125a在卵母细胞到2细胞发育阶段呈下降趋势，以后随发育进程呈逐渐上升趋势；miR?181b可能由于表达丰度低未能得到定量结果，仅在终点PCR产物电泳结果证实其在各个发育阶段均表达. 哺乳动物着床前胚胎发育过程是与其细胞增殖、凋亡和分化相互联系的；在卵母细胞阶段基因组主要来源于母源型，到2细胞阶段是合子型基因组的激活，从2细胞到8细胞发育阶段主要是卵裂的过程，而囊胚阶段开始出现细胞的向各个胚层的分化. 通过我们的研究，似乎miRNA的表达水平的变化是引起着床前胚胎基因组激活的一个重要方面，miRNA在着床前胚胎中发挥了极为重要的促进发育和分化的作用，并可能在胚胎发育过程中母型基因向合子型基因调控过渡的关键事件中起作用. 经系统查阅国内外文献目前尚无相关报道，本研究发现并提出在着床前胚胎中miRNA的表达及可能对着床前胚胎发育的作用，为深入研究miRNA在着床前胚胎发育中的功能奠定了基础.

    致谢: 衷心感谢香港中文大学韩毅冰博士、杨凌农林科技大学严兴荣博士和北京博奥公司张亮博士在实验过程中给予的热情指导和无私帮助.

【文献】
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