卵泡刺激素受体在成年化疗大鼠卵巢中的表达

               作者：罗璐，杨冬梓，王箴，莫亚勤，杨炜敏
 

【摘要】  目的： 探讨化疗药物所致的卵巢病理损伤以及FSHR在化疗卵巢中的表达. 方法： 将成年大鼠随机分为两组： 生理盐水组和环磷酰胺组. 大鼠单次腹腔注射环磷酰胺, 观察卵巢形态学改变并计数卵泡数目. 荧光定量PCR方法检测大鼠卵巢FSHR mRNA的表达. 结果： 环磷酰胺可引起原始卵泡大量丢失，卵巢间质严重损害，且卵巢局部发生纤维化. 化疗组卵巢窦卵泡比例显著低于对照组（P<0.05）；化疗组大鼠动情周期日数［（6.83±1.12）d］显著高于对照组［(4.50±0.82)d，P<0.05］. 荧光定量PCR显示，环磷酰胺组FSHR mRNA水平显著低于对照组（P<0.05）. 结论： 化疗大鼠卵巢FSHR表达减少，可能是导致化疗卵巢局部窦卵泡比例减少和动情周期延长的原因之一.

【关键词】  药物疗法；卵巢；受体，FSH；荧光定量PCR

      0引言

    临床上，女性癌症患者在接受化疗药物后多短暂性闭经，随之月经恢复，但日后月经紊乱和卵巢早衰的发生率显著升高［1］. 一般认为，化疗影响卵巢功能的机制有两种可能:一为直接影响卵巢激素产生，二为干扰甾体激素效应，即通过作用于下丘脑或者垂体而发挥其干预作用. 最近的几组临床资料显示了接受化疗的妇女其卵巢局部雌激素水平显著降低［2］. 近年研究发现, 卵泡刺激素受体( follicle stimulating hormone receptor,  FSHR)基因与卵泡的发育、雌激素的产生以及性腺的状态密切相关；卵巢的反应性亦与卵巢局部FSHR表达水平的高低有关［3］. 本研究以大鼠为模型，检测化疗卵巢局部FSHR的表达情况, 以期深入探讨化疗药物损伤卵巢的具体机制.

    1材料和方法

    1.1材料健康6 wk龄SD雌性大鼠36只，购自中山大学动物试验部，试验动物遗传背景稳定，所处环境为SPF级. 鼠笼、饲料、饮水和室内空气均经消毒处理. 动物平均体质量为(200±10)g. 采用完全随机分组方法，将动物随机分为2组: 生理盐水组和环磷酰胺组（60 mg/kg）. 大鼠一次性接受腹腔注射生理盐水或环磷酰胺; 注射时注意每次从同一位置同一角度进针.

    1.2方法

    1.2.1卵巢处理于术后8 wk(±5 d)将大鼠麻醉，无菌状态下开腹，取双侧卵巢. 一侧立即投入40 g/L甲醛固定12~24 h，用于HE染色. 另一侧无菌取出卵巢，置于冰上，使用生理盐水冲洗局部血液，并用无菌镊轻轻除去周围的脂肪组织，将卵巢置于无菌Ep管内（冰上），留待提取mRNA. 取自制微细棉签蘸以生理盐水后,轻轻于大鼠阴道内旋转1圈,行阴道涂片,用950 mL/L乙醇固定5 min, HE染色,显微镜下观察,以确定发情周期. 术后8 wk于动情期处死大鼠.

    1.2.2卵泡计数卵泡分类标准描述［4］. 原始卵泡计数以卵母细胞核作为标记物. 连续5 μm切片，间隔切片计数. 初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡计数以卵母细胞核仁为标记物观察每张切片. 按照上述方法，计数每个标本原始卵泡和窦卵泡数. 采用单盲法独立观察所有切片.

    1.2.3卵巢总RNA的提取无菌状态下分离大鼠卵巢组织, 液氮冷冻后置于研钵中捣碎匀浆. 将样品组织挑入高压灭菌的1.5 mL Eppendof管中,每管加1 mL DEPC水,混匀,吸去上清,重复以上操作. 将冲洗后的组织挑出，加液氮，研碎. 将研磨好的样本放入新的1.5 mL Eppendof管，加入1 mL Trizol，混匀，室温静置15 min. 再加入200 μL氯仿，颠倒混匀，室温静置10 min，13 000 g离心10 min. 取上清液转移至新的1.5 mL Eppendof管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10 min，13 000 g离心10 min. 弃上清，加1 mL 750 mL/L乙醇（用DEPC水配置）洗涤沉淀，8500 g离心5 min，吸去上清. 空气干燥沉淀，加40 μL DEPC水溶解RNA.  -20℃冰箱保存备用.

    1.2.4引物设计设计大鼠FSHR荧光定量PCR引物. 上游引物：5′? GTCCTCATCAAGCGACACCA ?3′；下游引物: 5′?GGAGGCAGAAATGGCAAAGA?3′.  片断全长103 bp. 大鼠GADPH内参照荧光定量上游引物：5′?CTCCCATTCCTCCACCTTTG?3′；下游引物: 5′?CTCCCATTCCTCCACCTTTG?3′. 片断全长110 bp. 引物均由Invitrogen公司合成.

    1.2.5荧光定量PCR检测FSHR mRNA取4 μL RNA模板做逆转录反应，反应体系如下：5×逆转录buffer  4 μL; 上游引物 (10 pmol/μL) 0.4 μL;下游引物 (10 pmol/μL) 0.4 μL; dNTPs（10 mmol/μL）0.2 μL; MMLV  （200 U/μL）1 μL; DEPC水 9 μL; RNA模板 5 μL; 总体积20 μL. 逆转录buffer成分：50 mmol  Tris?HCl (pH8.0), 50 mmol  KCl, 4 mmol  MgCl2, 10 mmol  DTT. 反应条件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 min. 荧光定量PCR反应，样本按以下反应体系进行：  5×定量PCR buffer（美国ABI公司）10 μL； 上游引物F（10 pmol/μL）1 μL；下游引物R（10 pmol/μL）     1 μL；SYBR Green I  1 μL；dNTPs（10 mmol）（Sigma公司）1 μL；Taq 酶1 μL；cDNA  5 μL；ddH2O 30 μL；总体积50 μL. PCR buffer成分：10 mmol Tris?HCl(pH 8.0),50 mmol  KCl, 2 mmol MgCl2. 反应条件为：93℃ 3  min，然后93℃ 45 s，55℃ 1 min，共40个循环. 反应结束后，由电脑自动分析并记录相应CT值. 使用CT值比较法对结果进行分析，其公式是：相对含量（%）= 2-ΔΔCT×100%. 所用内对照是GADPH基因，测定结果均为CT值. 计算相对于基准样品的ΔΔCT,相对基因含量,处理/未处理.

    统计学处理:  应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，所用统计分析方法有t检验和直线相关分析.

    2结果

    2.1环磷酰胺作用下成年大鼠卵巢的病理特征术后8 wk环磷酰胺作用下的成年大鼠卵巢可见间质血管充血，管壁增厚变性，局部发生纤维化,尚可见残留的卵泡(图1).

    A：环磷酰胺作用下原始卵泡丢失组大鼠残存的原始卵泡和初级卵泡；B：环磷酰胺作用下原始卵泡严重丢失组大鼠卵巢间质血管损伤, 管腔变窄，卵巢大面积严重纤维化.

    图1环磷酰胺处理组大鼠卵巢HE ×2002.2环磷酰胺作用下成年大鼠卵巢原始卵泡和窦卵泡计数与对照组相比，化疗组卵巢原始卵泡数目显著性减少,窦卵泡/窦前卵泡比例显著降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）.

    2.3环磷酰胺作用下成年大鼠动情周期的变化动情周期确定:于动情前期见大量有核上皮细胞, 动情期见大量无核角化细胞,动情后期见角化细胞和白细胞以及少许有核上皮细胞,动情间期见大量白细胞. 环磷酰胺作用下成年大鼠术后动情周期恢复；实验组大鼠动情周期日数为(6.83±1.12) d,显著高于对照组［(4.50±0.82) d, P<0.05］.

    2.4环磷酰胺作用下成年大鼠FSHR mRNA的荧光定量表达使用荧光定量PCR方法，我们检测了化疗大鼠卵巢FSHR mRNA的表达. 统计结果显示，环磷酰胺组FSHR mRNA的水平低于对照组, 差异有统计学意义［（0.85±1.03)  vs (0.38±0.74), P<0.05］. 所有检测样本未发现基因组DNA的污染，所有阴性对照未见扩增产物.

    2.5相关因素分析   相关分析表明，化疗卵巢FSHR与窦卵泡比例呈正相关关系（r= 0.755, P<0.05），与大鼠动情周期日数呈负相关关系（r=0.781, P<0.05）.

    3讨论

    本研究中，化疗8 wk后的卵巢虽然可见一定数量的原始卵泡，动情周期亦可恢复，但卵巢间质的血管损伤和局部纤维化仍为其主要的病理改变. 近年发现,卵巢局部血液供给是决定卵巢反应性和状态的重要因素之一. 化疗8 wk时大鼠卵巢异常的病改变，很可能是其表现为动情周期延长的“结构基础”.

    FSH 是腺垂体分泌的一种糖蛋白激素, 主要促进女性卵巢内的卵泡发育. FSH主要通过与卵巢颗粒细胞膜表面的特异性卵泡刺激素受体(FSHR) 相结合,激活FSHR启动子, 活化RNA 聚合酶,使之与模板DNA准确地结合并启动基因转录, 引起FSHR 基因转录后水平的变化, 从而介导促性腺激素的反应信号, 导致第二信使产生以及激发后续的细胞内反应、颗粒细胞的增殖分化和雌激素的产生, 参与卵泡和生殖细胞的发育和成熟, 从而影响女性卵巢的生殖和内分泌功能［5］. FSHR 结构、功能和数量发生改变会直接影响到FSH 作用的发挥. 体外将FSHR质粒转染大鼠颗粒细胞,证实FSH信号传导功能取决于颗粒细胞表面FSHR的密度和转染的FSHR质粒数量.FSHR密度越高,信号越强;转染的FSHR质粒越多,信号传导功能越大［6］. 一项临床研究结果发现［7］, 颗粒细胞FSHR表达水平与卵巢的反应性有关,低反应组患者FSHR表达低、卵泡发育少、雌二醇峰值低; 而高反应组FSHR表达高、获卵数多、雌二醇峰值高；另外, FSHR蛋白的表达量与卵泡数和血清雌二醇峰值呈显著正相关关系. 本研究发现，化疗大鼠动情期卵巢局部FSHR mRNA表达显著减少，而且与窦卵泡比例和发情周期具有高度相关性，提示我们尽管化疗状态下FSH水平可能升高，但卵巢局部较低的FSHR密度将削弱FSH?FSHR的信号传导强度，影响其生物学作用的发挥，即卵泡发育或成熟受到影响，从而使得大鼠在动情周期方面发生异常表现. 本研究未检测卵巢局部雌激素水平的变化，主要是考虑到现有的商品化大鼠卵巢激素检测试剂盒尚存在很多缺陷，可能会对结果分析造成一定的影响.

    国外学者进行了重金属铅等对于卵巢生殖毒性的影响，结果发现，铅和镉等都可以明显减少卵巢促性腺激素的结合能力，并改变颗粒细胞甾体激素生成酶的活性；同时这种改变与颗粒细胞胞膜的改变呈显著正相关［8］. 我们的结果与上述研究结果一致. 旁分泌因子可能参与FSHR 表达的调节［9］. 用表皮生长因子、成纤维生长因子或胰岛素样生长因子等刺激颗粒细胞, 可减弱其对FSH 作用的反应. 因此, 有理由推测化疗状态下FSHR 表达的减少与卵巢局部异常分泌的某些旁分泌因子有关. 卵巢局部细胞因子的功能紊乱和生长因子系统的异常调节、以及其与FSHR的相关性研究，将有助于深入探讨化疗状态下卵巢功能低下的分子机制.

【】
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