复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱与保肝作用的谱效关系
作者：窦志华，罗琳，丁安伟，王陆军，张兵，李民
【摘要】 目的： 阐明复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础. 方法： 将大鼠灌胃给药分别制备复方五仁醇胶囊及五味子、三七、柴胡、叶下珠4味药的阴性制剂和单味制剂含药血清，对获得的9组含药血清按已经建立的指纹图谱条件进行HPLC测定，同时考察它们对CCL4诱导的损伤肝细胞的增值（MTT法）及丙氨酸氨基转移酶（ALT）泄漏的影响，最后进行谱效关系分析. 结果： 指纹图谱显示，单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清中均检测到大鼠灌服全方制剂后血液中产生的13个药源性成分，而五味子阴性制剂及单味三七、柴胡、叶下珠含药血清中均未检测到药源性成分；药效结果显示，全方、单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清对肝细胞损伤均具有明显的保护作用，而单味三七、柴胡、叶下珠含药血清及五味子阴性制剂含药血清作用不明显，且单味五味子与全方制剂含药血清组之间药效无显著差异. 谱效之间具有很好的相关性. 结论： 复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础主要来自君药五味子所含有的木脂素类成分.
【关键词】 复方五仁醇胶囊；含药血清；指纹图谱；保肝作用；谱效关系；色谱法，高压液相
0引言
中药血清药和血清药化学是一种很有前景的研究复方的新思路，两者的结合研究有助于中药药效物质基础的阐明［1］. 复方五仁醇胶囊由五味子、三七、柴胡及叶下珠等4味药组成，其中五味子为君药，是一种慢性肝炎的科研制剂［2］，我们以该制剂为对象进行血清药理学与血清药化学相结合探寻中药复方药效物质基础的方法学探讨. 我们曾采用正交试验法优选了该制剂含药血清制备条件，建立了以CCL4诱导的原代培养大鼠肝细胞损伤模型对含药血清进行药效评价的方法，并分别进行了体外制剂、含药血清的HPLC指纹图谱研究［3-4］. 在此基础上，我们研究制备了全方制剂含药血清及拆方后的各组方药材阴性制剂和各单味制剂含药血清，分别对这9组含药血清按已经建立的指纹图谱条件进行HPLC测定和药效评价，试图通过谱效关系分析初步阐明该制剂保肝作用的药效物质基础.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量（248.4±16.3）g，南通大学实验动物中心提供，许可证号SYKX（苏）2002?0022；Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括G1311A 四元泵，G1379A 脱气装置，G1313A 自动进样器，G1314A VWD紫外检测器，HP ChemSation工作站）；HERA cell CO2培养箱（德国GmbH公司）；BIO?TEK340酶标仪（美国Sigma公司）；日立7170全自动生化分析仪（日本日立公司）；CKX41型倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；XW?80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，香港FARCO公司，批号L0024LJ0101M21）；乙二醇双（2?氨基乙醚）四乙酸（EGTA，美国AMRESCO公司，批号0732）；胶原酶IV（美国Sigma公司，批号0406）；胰蛋白酶（美国Sigma公司，批号030702）；DMEM培养基（美国Gibco公司，批号1255136）；四氯化碳（宜兴市第二化学试剂厂，批号20010608）；溴化3?(4,5?二甲基噻唑)?2,5?二苯基四氮唑蓝（MTT，美国AMRESCO公司，批号1324B37）；新西兰新生小牛血清（美国HyClone公司，批号DPEO166）；复方五仁醇胶囊及其各组方药材阴性制剂、单味制剂（南通大学附属南通第三，批号050505）；色谱纯甲醇（江苏汉邦科技有限公司）；色谱纯乙腈（美国TEDIA公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯.
1.2方法
1.2.1含药血清和空白血清的制备按［4］方法制备大鼠含药血清和空白血清.
1.2.2各组含药血清的HPLC测定按文献［4］方法制备大鼠含药血清和空白血清供试品溶液，并分别吸取含药血清、空白血清供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，记录70 min色谱图.
1.2.3原代肝细胞的分离培养、分组及处理大鼠用30 g/L戊巴比妥钠以1.5 mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，开腹，门静脉插管，以37℃无钙灌流液（组成：HBSS 500 mL，HEPES 1.19 g，EGTA 0.095 g，NaHCO3 0.175 g，pH 7.4）灌流约20 min后，换用37℃的通氧胶原酶灌流液（组成：HBSS 100 mL，HEPES 0.238 g，CaCL2 0.07g，胶原酶IV 0.075 g，胰蛋白酶 0.01 g，NaHCO3 0.035 g，pH 7.4）继续灌流10 min后取下肝脏，剪开肝包膜，将肝细胞悬液过滤清洗后悬浮于含100 mL/L新生小牛血清的DMEM培养基中，并用台盼蓝染色法检测细胞活力达90％. 将肝细胞随机分成11组，即正常对照组、模型对照组、全方制剂含药血清组、阴性制剂含药血清4组和单味药含药血清4组，每组设6个复孔，以1×105个/cm2接种于96孔及48孔板中，置CO2培养箱37℃培养. 细胞培养24 h后，弃上清液，模型对照组和各试验组更换为加入CCL410 mmol/L的DMEM培养液，正常对照组用DMEM培养基，并在各试验组中加入终浓度为100 mL/L各含药血清，正常对照组和模型对照组加入终浓度为100 mL/L的空白血清，作用24 h后，收集48孔板中培养上清液检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）. 96孔板中每孔加入5 g/L的MTT液20 μL，继续孵育4 h，每孔再加入DMSO 200 μL，振荡后用酶标仪测A570 nm，其值越高说明细胞活力越强.
统计学处理：数据以x±s表示，使用stata7.0统计软件包进行统计处理，样本数据比较采用单因素方差分析和HSD检验，以P<0.05为显著性判断界值.
2结果
2.1各组血清的HPLC检测与空白血清色谱图比较，全方制剂含药血清中产生了13个药源性成分，单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清中均检测到了这13个成分，而五味子阴性及单味三七、柴胡、叶下珠制剂含药血清均未发现药源性成分（图1~4）.
图1五味子(A)、五味子阴性(B)、全方(C)含药血清及空白血清(D)色谱图
图2三七(A)、三七阴性(B)、全方(C)含药血清及空白血清(D)色谱图
图3柴胡(A)、柴胡阴性(B)、全方(C)含药血清及空白血清(D)色谱图
图4叶下珠(A)、叶下珠阴性(B)、全方(C)含药血清及空白血清(D)色谱图
2.2各组含药血清对肝细胞活力及ALT泄漏的影响与正常对照组比较，模型对照组细胞MTT值显著下降（P<0.01，表1），上清液中ALT显著升高（P<0.01），表明造模成功；与模型对照组比较，全方、三七阴性制剂及柴胡阴性制剂含药血清组MTT值显著提高（P<0.01），单味五味子MTT值有下降趋势，但无统计学意义. 全方、单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清组ALT均明显降低（P<0.01），三七、柴胡及叶下珠在方中作用不明显；与全方含药血清组比较，单味三七、柴胡、叶下珠及五味子阴性制剂含药血清组MTT值均明显降低（P＜0.01），ALT均明显升高（P＜0.01），而单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清组MTT值及ALT则均没有差异.
3讨论
关于动物或人服用药物后血液中产生的与药物因素有关的成分目前还没有统一的定义，有学者将其统称为“血中移行成分”［5］，我们将其统称为“血中药源性成分”［6］，包括药物原形成分及其代谢产物，也包括药物因素诱导体内产生的内源性成分.
大鼠灌胃复方五仁醇胶囊后血液中产生13个药源性成分并且全部来自君药五味子经10批含药血清指纹图谱的检测证实，其中8个为制剂原形成分（色谱图中的6至13号峰），5个为代谢产物（色谱图中的1至5号峰）［4］，8个原形成分中的7个分别被鉴定为五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、五味子甲素、戈米辛N、五味子乙素和五味子丙素，并且所有13个成分的紫外光谱均具有木脂素类成分的吸收特征（待发表）. 表1肝细胞增殖及培养上清液中丙氨酸氨基转移酶测定
本次药效研究结果显示，全方、单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清对肝细胞损伤均具有明显的保护作用，而单味三七、柴胡、叶下珠含药血清作用不明显，且单味五味子与全方制剂含药血清组之间药效无显著差异，谱效之间具有很好的相关性，提示复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础主要来自君药五味子所含的木脂素类成分.
【】
［1］ 潘卫松，刘美凤，石钱，等. 血清药、血清化学和中药药代动力学［J］．世界技术中药化，2002，4（3）：51-55.
［2］ 窦志华，施忠，李伟红，等. 复方五仁醇胶囊的研制［J］．时珍国医国药，2005，16（10）：953，957.
［3］ 窦志华，丁安伟，王陆军，等. 复方五仁醇胶囊HPLC指纹图谱研究［J］．山东中医药大学学报，2006，30（5）：384-387.
［4］ 窦志华，丁安伟，王陆军，等. 复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱研究［J］．药学杂志，2007，42（12）：892-895.
［5］ 王喜军，张宁，孙晖，等. 六味地黄丸的血清药物化学研究［J］．中国天然药物，2004，2（4）：219-222.
［6］ 窦志华，丁安伟，王陆军，等. 复方五仁醇胶囊血清药化学研究［J］．中草药，2006，37（8）：1137-1140.
