糖尿病早期大鼠坐骨神经形态学的实验研究
【关键词】 糖尿病；大鼠；周围神经病变
ＡｂｓｔｒａｃｔObjective：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ， ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｆｆｅｒ ａｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｂｅｉｎｇ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐｈａｔｈｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｏｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ）．Ａｆｔｅｒ ６ ｗｅｅｋｓ， ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｓｕｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ with light microscope and electron microscpe．Ｒｅｓｕｌｔｓ： Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｉｂｅｒｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｆｅｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ ＜０.０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐｈａｔｈｙ ｏｆ ＳＴＺ?ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ， ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐｈａｔｈｙ． Ｉｔ ｃｅｒｔｉｆｉｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐｈａｔｈｙ ｉｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ；rat;peripheral neurophathy
为了研究早期糖尿病（ＤＭ）大鼠坐骨神经形态学的改变，我们采用链脲佐菌素诱导大鼠建立糖尿病模型，观察ＤＭ大鼠６周末坐骨神经病理形态的变化，为糖尿病周围神经病变动物模型的确立提供依据。
１ 材料与方法
１.１ 材料
１.１.１ 主要仪器
（１）日本ＪＥＭ１００ＣＸⅡ型透射电镜；（２）德国罗氏公司Ａｃｃｕ – ＣＨＥＫ型电感血糖仪；（３）德国ＬＥＩＣＡ ＲＭ２１３５型精密轮转切片机；（４）北航ＣＭＩＡＳＷＩＮ ＳＹＳＴＥＭ多功能真彩色病理图像分析系统。
１.１.２ 主要药品
链脲佐菌素（ＳＴＺ）购于北京邦定泰克生物制药有限公司（美国Ｓｉｇｍａ公司）。
１.２ 方法
１.２.１ 动物模型的建立及分组
健康清洁级（ＳＰＦ级）ＳＤ雄性大鼠２０只，体重为（２２０±２０）ｇ，购于北京维通利华实验动物有限责任公司。适应性喂养１周后，按体重层次随机取１０只为正常对照组，１０只为造模组。用０.１ ｍｍｏｌ/Ｌ无菌枸橼酸缓冲液（ｐＨ=４.２，４ ℃），将ＳＴＺ配成２％的溶液，大鼠禁食１０ ｈ后，按５３ ｍｇ/ｋｇ腹腔注射，７２ ｈ后测定血糖大于１６.６５ ｍｍｏｌ/Ｌ者列入观察对象；正常对照组正常喂养。
１.２.２ 标本采集
实验至第６周结束，腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠（０.４ ｍｌ/１００ ｇ），分离双侧坐骨神经，一侧神经用１０％甲醛固定待作光镜；另一侧坐骨神经置２.５％戊二醛中待作电镜。
１.２.３ 光镜及电镜标本的制作
光镜标本：取１０％甲醛固定的坐骨神经用水洗，１％锇酸染色，常规脱水、石蜡包埋，德国ＬＥＩＣＡ ＲＭ２１３５型精密轮转切片机连续切片，厚５ μｍ，在４０×１０倍视野下观察其横切面及纵切面病理变化。电镜标本：取１ ｍｍ２大小２.５％戊二醛（０.０５ ｍｍｏｌ/Ｌ）固定的坐骨神经组织，用１％锇酸固定，Ｅｐｏｎ８１２包埋，超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅双染色，乙醇丙酮梯度脱水，ＪＥＭ１００ＣＸⅡ型透射电镜观察有髓鞘神经纤维脱髓鞘及胞质等病理改变并摄片。
１.２.４ 检测指标及方法
血糖测定：分别于疗前及实验结束后，用罗氏公司生产血糖仪测定血糖。
坐骨神经病理图像分析：每例组织测定一组神经，测定参数为有髓神经纤维平均截面积、有髓神经纤维周长、有髓神经纤维密度等。
１.２.５ 统计学方法
各组数据均用ｘ±ｓ表示，组间比较采用单因素方差分析，Ｆ检验，用ＳＰＳＳ１０.０版统计软件处理。
２ 结果与分析
２.１ 大鼠血糖变化（表１）表１ 各组大鼠疗前及疗后血糖的变化比较（略）注：与正常对照组比较１）Ｐ＜０.０１；与疗前比较２）Ｐ＜０.０１
表１示ＤＭ大鼠血糖与正常组比较明显升高（Ｐ＜０.０１）。ＤＭ组疗后血糖与疗前比较有明显升高（Ｐ＜０.０１），说明随病程延长，糖尿病大鼠血糖有增高趋势。
２.２ 坐骨神经病理图像分析结果（表２）
表２坐骨神经病理图像分析结果显示：与正常对照组相比，糖尿病模型神经纤维平均截面积略增大、有髓鞘神经纤维密度减少，轴索平均周长较正常组增大（Ｐ＜０.０１）。表２ 各组大鼠坐骨神经有髓鞘神经纤维病理图像分析结果（略）注：与正常对照组比较１）Ｐ＜０.０１
２.３ DM大鼠坐骨神经光镜及电镜观察结果（图１~６） 图1和图3为正常组图片。
电镜下观察：糖尿病模型组可见有髓鞘神经纤维板层分离，呈严重脱髓鞘现象，轴突内微丝微管排列紊乱（图５）。雪旺氏细胞核呈不规则形，胞质内粗面内质网扩张，线粒体呈空泡样改变，雪旺氏细胞基膜断裂（图６）。图２ 模型组大鼠坐骨神经横切面锇酸染色×４００（箭头示轴索肿胀、空泡样变性）图３ 正常组大鼠坐骨神经纵切面锇酸染色×４００图４ 模型组大鼠坐骨神经纵切面锇酸染色×４００（箭头示轴索变性及脱髓鞘改变）
３ 讨论
糖尿病周围神经病变（ＤＰＮ）是ＤＭ最常见的三大慢性并发症之一，报道：ＤＰＮ发病率随病程延长可达９０%以上［１］，严重地影响了DM患者的生活质量，甚至使DM患者致残，导致了巨大的和社会负担。
建立较理想的动物模型对于深入研究ＤＰＮ具有十分重要的意义。目前尚无理想的ＤＰＮ动物模型，主要是采用ＤＭ动物模型［２~8］。已有实验证实，大鼠成模后１~２个月就可观察到与人类ＤＰＮ相似的改变。我们采用ＳＴＺ诱导大鼠建立了ＤＭ模型，观察其周围神经病理形态学的变化，为ＤＰＮ模型的成立提供理论依据。
Ｍｏｒｄｅｓ等报道，选用雄性大鼠制备模型成模率明显高于雌性大鼠［9］。Ｍａｓｉｅｌｌｏ等研究表明，大鼠对ＳＴＺ的敏感性具有年龄依赖性，成鼠或大体重鼠较幼鼠或小体重鼠更易成模［１0］。本研究选用大体重雄性大鼠造模效果较好。另外用本模型可以观察从ＤＭ发病到出现神经损害以致加重的完整过程，更接近于人类ＤＰＮ发病情况，符合ＤＰＮ的重要临床和病理特征。国内研究报道［１1］：DM大鼠成模第２周时伤害性爪回缩阈值明显降低，提示ＤＭ大鼠处于痛过敏状态。我们观察了造模６周末大鼠坐骨神经的病理形态变化，结果光镜下均可见坐骨神经纤维肿胀、空泡样变性。部分髓鞘脱失，病理图像分析结果与电镜结果相符。由此可见，我们采用ＳＴＺ诱导的ＤＭ模型已基本具备了ＤＰＮ的主要特征，反应了ＤＰＮ的病理特点，因此，用此模型进行有关ＤＰＮ的研究具有可行性。本实验结果提示ＤＰＮ模型建立成功。
【文献】
［１］梁晓春，郭赛珊．糖尿病神经病变的思路与方法［Ｊ］．中医杂志，１９９９，４０（１）：５２－５３．
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［４］Ｂａｙｎｅｓ ＪＷ， Ｔｈｅｏｒｐｅ ＳＲ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ａ ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ａｎ ｏｌｄ ｐａｒａｄｉｇｍ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９９， ４８（１） ：１．
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［６］Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＤＲ．Ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ，１９９８， ２４（ｓｕｐｐｌ３）：７９．
［７］Ｖｅｖｅｓ Ａ， Ａｋｂａｒｉ ＣＭ， Ｐｒｉｍａｖｅｒａ Ｊ， ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ ｆｏｏｔ ｕｌｃｅｒａｔｉｏ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９８，４７（３） ：４５７．
［８］Ｃｏｔｔｅｒ ＭＡ，Ｊａｃｋ ＡＭ， Ｃａｍｏｒｏｎ ＮＥ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＬＹ３３３５３１ ｏｎ ｎｅｕｒａｌ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ?ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ，２００２， １０３ ：３１１－３２１．
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［１1］刘健，王克模，曹东元，等．大鼠糖尿病痛过敏模型的建立［Ｊ］．西安医科大学学报，１９９６，１７（２）：１３６－１３９．
