黄贝平甲胶囊与他巴唑联用对Graves病小鼠细胞因子的影响

           作者：李晓苗，厚荣荣，李源，谢永宏，陈建宗，冯秀亮 

【摘要】  　　目的： 观察黄贝平甲胶囊与他巴唑联合应用对毒性弥漫性甲状腺肿（Graves病）小鼠血清中细胞因子水平的影响. 方法： 用BALB/c雌性小鼠建立Graves病动物模型，在用药物干预后，采用放射免疫分析及夹心ELISA方法检测小鼠血清TT4，TSH, TRAb及细胞因子IL?2, IL?6, TNF?α, IFN?γ水平变化. 结果： 后黄贝平甲胶囊组小鼠血清中TT4，TRAb水平较模型组明显降低(P<0.05)，而TSH水平改变不大，差异无统计学意义；他巴唑组, 他巴唑+黄贝平甲胶囊组小鼠血清中TT4，TRAb水平均较模型组显著降低，而TSH水平明显升高(P<0.05)；TNF?α, IFN?γ水平变化比模型组显著降低(P<0.05)，以联合应用组更为明显，但仍明显高于正常对照组(P<0.05). 联合应用组与模型组相比IL?2有所升高(P<0.05)；联合应用组与模型组相比IL?6明显降低(P<0.05). 结论： 黄贝平甲胶囊和他巴唑联合应用对Graves病小鼠血清中细胞因子水平有明显的改善作用，较单独使用他巴唑或黄贝平甲胶囊疗效更为有效.

【关键词】  格雷夫斯病；黄贝平甲胶囊；细胞因子类

    【Abstract】AIM:  To observe the effects of Huangbei Pingjia capsule and methimazole on cytokines in mice with Graves? disease. METHODS:  BALB/c female mouse was used as a Graves? disease model. After treatment, TT4, TSH, TRAb, IL?2, IL?6, TNF?α and IFN?γ were measured by radioimmunoassay or sandwich ELISA.  RESULTS: Huangbei Pingjia capsule or methimazole alone could not improve the above items of model mice significantly, while, combination of Huangbei Pingjia capsule with methimazole improved them  markedly. CONCLUSION: Combination of Huangbei Pingjia capsule with methimazole improves the levels of cytokines in mice with Graves? disease significantly and the curative effect is better than methimazole alone.

    【Keywords】 Graves? disease; Huangbei Pingjia capsule; cytokines

　　  0引言

    　　　毒性弥漫性甲状腺肿（Graves disease, GD）是最常见的自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)，其发病机制复杂，近年来，细胞因子在Graves病发病中所起的作用越来越受到重视. 除浸润甲状腺的淋巴细胞可以分泌多种细胞因子外，甲状腺细胞既可表达部分细胞因子受体，也可合成并释放多种细胞因子. TNF?α, IFN?γ, IL?2和IL?6是目前在AITD中研究较多的细胞因子. 我们在他巴唑等抗甲状腺药物常规治疗的基础上，给患者加服纯中药复方制剂黄贝平甲胶囊，在一定程度上起到了“增效减毒”的效果［1］. 但有关他巴唑，黄贝平甲胶囊对Graves病发病中对细胞因子的影响却少见报道. 本研究通过观察黄贝平甲胶囊与他巴唑联合应用对Graves病小鼠血清中细胞因子TNF?α, IFN?γ, IL?2, IL?6水平的影响，旨在进一步探讨其作用机制.

    1材料和方法

    1.1材料EcoR I, XbaI, SalI 限制性内切酶(日本TaKaRa公司)；甲状腺素（TT4）放射免疫分析药盒(北京原子能高科核技术应用股份有限公司)；促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析药盒(天津协和医药科技有限公司)；TSH受体抗体（TRAb）放射免疫试剂盒(德国Medipan公司)；IL?2, IL?6, TNF?α检测试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司)；干扰素?γ（IFN?γ）检测试剂盒(北京晶美生物工程有限公司). 健康清洁级雌性BALB/c小鼠110只，6～8 wk龄，体质量23～28 g，动物饲养环境为清洁级（由第四军医大学动物实验中心提供）. pSV2?neo?TSHR289由北京中医药大学胡元会教授惠赠. 黄贝平甲胶囊(主要成分为黄药子、贝母、连翘、生地)由第四军医大学生产.

    1.2方法

    1.2.1模型构建用EcoRI+XbaI分别双酶切目的基因质粒pSV2?neo?TSHR289和pUC18质粒，经连接、转化、筛选得到重组质粒pUC18?TSHR289，再用EcoRI+SalI 双酶切pUC18?TSHR289和穿梭质粒pDC316，将含SalI末端的TSHR289基因片段连接到pDC316上. 将重组质粒pDC316?TSHR289和重组腺病毒骨架质粒pBHGloxdel E13cre共转染293细胞，出现噬斑后冻溶细胞3次，收集上清，经鉴定正确后接种289细胞进行大量扩增，用阴离子交换柱层析纯化，一次性滤器过滤除菌，经典方法测定半数毒性剂量TC50值［2］， Ad?TSHR289滴度约为4.6×1012 IU/L，-70℃保存备用. 将BALB/c小鼠用Ad?TSHR289免疫. 取已构建好的Ad?TSHR289 5×107 IU ，用PBS稀释至50 μL 直接经胫前肌注射小鼠，每隔3 wk免疫1次，共3次，并于第3次免疫后2 wk断尾取血，以放射受体分析法测定小鼠血清TT4, TSH,  TRAb，以TRAb阳性同时伴TT4升高，TSH水平降低者为造模成功. 在造模过程中因各种原因共计死亡10只，造模成功100只，均用于下述实验.

    1.2.2药物干预实验分为正常对照2个（1，2）组和动物模型8个组（即模型（1，2）组，他巴唑（1，2）组，黄贝平甲胶囊（1，2）组和他巴唑+黄贝平甲胶囊（1，2）组），每组10只. 正常对照（1，2）组和模型（1，2）组给予生理盐水灌胃；他巴唑（1，2）组：按10 mg/kg给予他巴唑；黄贝平甲胶囊（1，2）组：按9 g/kg给予黄贝平甲胶囊；他巴唑+黄贝平甲胶囊（1，2）组：给予10 mg/kg他巴唑+9 g/kg黄贝平甲胶囊. 供给药6 wk，各组生理盐水及药物灌胃量均为1 mL/（kg·d）.

    1.2.3指标检测小鼠在末次给药后1 wk以30 mg/kg给予10 mL/L戊巴比妥麻醉，腹腔静脉采血后立即分离血清，部分血清采用放射免疫分析法作TT4，TSH和TRAb测定. 部分血清-20℃保存待测细胞因子，测定前置室温或冷水中复融，混匀，4℃ ，3000 r/min离心5 min，取上清测定. 采用放射免疫分析测定IL?2, IL?6和TNF?α，采用双抗体夹心ELISA法测定IFN?γ，操作均按说明书进行.

    统计学处理： 实验数据以x±s表示，统计分析采用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析， P< 0.05为差异具有统计学意义.

　　 2结果

    2.1黄贝平甲胶囊与他巴唑联用组对TT4， TSH， TRAb的影响模型1组小鼠的TT4，TRAb较正常对照1组明显升高，TSH明显降低，差异具有统计学意义 (P<0.05，表1). 与模型1组比较，黄贝平甲胶囊1组后的血清TT4，TRAb明显降低(P<0.05)，而TSH的改变无统计学意义. 他巴唑1组，他巴唑+黄贝平甲胶囊1组血清TT4，TRAb均较模型1组显著降低，而TSH明显升高(P<0.05). 他巴唑+黄贝平甲胶囊1组与他巴唑1组相比，各项指标改善更加明显，其差异具有统计学意义(P<0.05). 表1各组小鼠血清中的甲状腺激素水平

    2.2黄贝平甲胶囊与他巴唑联合应用组对血清TNF?α， IFN?γ， IL?2， IL?6的影响与正常对照2组相比，模型2组小鼠血清TNF?α，IFN?γ，IL?6显著升高， IL?2明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01，表2). 黄贝平甲胶囊2组与模型2组相比，各项指标的改善均无统计学意义. 给予他巴唑2组，他巴唑+黄贝平甲胶囊2组治疗后，血清TNF?α，IFN?γ比模型2组显著降低(P<0.05)，以他巴唑+黄贝平甲胶囊2组更为明显，但仍明显高于正常对照2组，差异具有统计学意义(P<0.05). 他巴唑2组IL?2和IL?6与模型2组相比无改变. 他巴唑+黄贝平甲胶囊2组IL?2与模型2组相比较虽有所升高(P<0.05)，但与正常对照2组相比仍明显降低(P<0.05)；他巴唑+黄贝平甲胶囊2组IL?6与模型2组相比明显降低(P<0.05)，接近正常水平.

    3讨论

    　　Graves病的发生与细胞因子有着重要联系. TNF?α主要由单核巨噬细胞产生，能在多个环节影响下丘脑?垂体?甲状腺，可导致TRH，TSH以及T3，T4水平的全面受抑. IFN?γ主要由活化的T淋巴细胞和NK细胞产生，可促进主要组织相容性复合体Ⅱ的表达，从而使甲状腺细胞变为抗原提呈细胞，参与甲状表2各组小鼠血清中的细胞因子水平腺的自身免疫反应；IFN?γ单独或与TNF?α联合使用可促进培养的人甲状腺细胞表达胞间黏附分子?1(ICAM?1)，加强效应T细胞识别与杀伤甲状腺细胞的能力［3］；同时，IFN?γ可以激活单核巨噬细胞，分泌大量IL?1，而IL?1又可促进自身抗原特异性T细胞的活化，增强参与细胞毒性作用的NK细胞等的活性，形成恶性循环，造成甲状腺组织的破坏［4］. IL?2是由Th细胞在抗原、丝裂原或IL?1诱导下分泌的一种糖蛋白，在生理情况下对甲状腺细胞功能有保护作用，而在病理情况下，由于免疫功能紊乱，IL?2的生成减少，减弱了其对甲状腺细胞的保护作用. IL?6主要由单核巨噬细胞、T细胞及纤维细胞等合成，是一种多功能的细胞因子，它可促进T前体细胞激活成为Tc细胞，刺激B淋巴细胞增殖分化、分泌免疫球蛋白等，与多种自身免疫性疾病发病机理密切相关. 有研究显示，当存在生理浓度的可溶性IL?6受体时，IL?6可呈剂量性或完全抑制甲状腺细胞的功能.

    　　我们的实验结果表明，黄贝平甲胶囊和他巴唑联用不仅对Graves病小鼠的甲功有改善作用，抑制TRAb的生成，更主要的是恢复了细胞因子水平. 与正常组相比较，Graves病小鼠TNF?α，IFN?γ，IL?6明显升高，IL?2明显降低，具有显著性差异. 单独使用黄贝平甲胶囊后，与Graves病模型组比较，除TT4降低外，其余各项指标无明显改善. 单独使用他巴唑后，血清TT4，TRAb，TNF?α，IFN?γ水平均较Graves病模型显著降低，TSH明显升高，IL?2和IL?6与模型组相比较无改善. 联合应用组除IL?2外，各项指标与模型组相比均有明显改善，而且较他巴唑组更为明显，TRAb，IL?6已接近正常水平. 这些数据表明，细胞因子与Graves病的发生发展密切相关，他巴唑单独使用或与黄贝平甲胶囊联合使用对Graves病小鼠血清中细胞因子水平异常有一定改善作用，他们对细胞因子的调节可能是改善甲状腺功能的原因之一. 而联合应用组各项指标改善更为明显，显示了中药在配合西药治疗时的“增效减毒”作用［5］.

【】
  ［1］ 李晓苗，陈建宗，张南雁，等. 黄贝平甲胶囊对甲状腺功能亢进症患者甲功及T淋巴细胞亚群的作用［J］. 第四军医大学学报,2001,22(2):148-150.

［2］ 殷震，刘景华. 动物病毒学 ［M］. 2版，北京: 出版社,1997：62-65.

［3］ Rasmussen AK. Cytokine actions on the thyroid gland［J］. Dan Med Bull, 2000, 47:94-114.

［4］ 邹建文，李卫国. Graves?病患者血清IFN?γ, IL?2及IL?6的动态观察［J］. 放射免疫学杂志, 2006, 19:183-185.

［5］张明，王春萍，孟作龙. 甲亢性肝病患者血清细胞因子的变化［J］. 第四军医大学学报,2006,27(10):958-959.