人cbl 基因真核表达载体的构建及表达
【Keywords】 cbl; polymerase chain reaction; cloning, molecular; gene expression
【摘要】目的： 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体，并检测其在真核细胞中的表达.方法： 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板，采用PCR方法扩增cbl基因，并在其N末端带上含24 bp的flag标签，克隆到pGEMT easy载体并测序，再亚克隆至真核表达载体pcDNA31(+)，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS7细胞，Western blot检测flagcbl在细胞中的表达. 结果： 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flagcbl融合基因的序列以及读框全部正确；重组质粒pcDNA31(+)flagcbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段；脂质体法转染COS7后检测到预期目的蛋白的表达.结论： 成功构建了N末端带flag标签的cbl真核表达载体，并使其在真核细胞COS7中表达.
【关键词】 cbl; 聚合酶链反应; 克隆，分子; 基因表达
0引言
Cbl (casitas Blineage lymphoma,简称Cbl)是一类广泛分布的细胞内蛋白，在哺乳类中有Cbl、Cblb和Cbl3 3种.Cbl分子中含有多个不同的结构域，可以介导与不同的细胞内分子结合，在细胞活化过程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导；同时该分子中的RING结构域能够与泛素结合酶E2结合,作为泛素连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素化－蛋白酶体降解，因此参与细胞内信号转导的负调控机制［1］.近年来的研究表明，突变的Cbl可成为癌基因［2］；而许多肿瘤细胞内与增殖有关的分子（如受体型蛋白酪氨酸激酶，RTK）发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.我们成功构建了N－末端融合有flag标签的cbl 基因的真核表达载体，并采用脂质体法转染培养的COS7细胞，检测其是否正确表达，为进一步研究cbl 对肿瘤细胞生长的影响奠定基础.
1材料和方法
11材料
大肠杆菌菌株DH5α、pcDNA31(+)真核表达载体、COS7细胞由本室保存；含人全长cbl cDNA的质粒由美国La Jolla变态反应与免疫学研究所保存；pGEMT easy购自Promega公司；dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、DL2000 DNA Marker购自Takara公司；1640培养基购自Gibico 公司；LipofectamineTM2000购自invitrogen公司；抗flag M2 mAb和抗ACTIN抗体、HRP标记的羊抗鼠、兔第二抗体分别购自Sigma公司和博士德公司；Western blot 所用发光底物为pierce公司产品；用于PCR反应的引物由上海生物工程公司合成；质粒提取和DNA 回收试剂盒由杭州维特洁公司提供.
12方法
121引物设计上游引物序列： 5′GGT ACC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG ATG GCC GGC AAC GTG AAG AAG AGC3′，其中GGT ACC为KpnI酶切位点.下划线部分为编码flag标签的核苷酸序列；下游引物序列： 5′ CTC GAG CTA GGT AGC TAC ATG GGC AGG AGA AGA AAT GG 3′，其中CTC GAG为XhoI酶切位点.
122PCR扩增flagcbl基因及产物修饰在25反应体系中加入25 μL 10×反应缓冲液，20 μL dNTP，pEFHAcbl 质粒模板10 μL，上下游引物各10 μL，pyrobest高保真酶025 μL，补水至25 μL.扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，35 cycles.扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离；回收后溶于35 μL去离子水中，并进行加“A”反应： 50 μL 反应体系中加入5 μL 10×反应缓冲液，4 μL dATP，3 μL MgCl2，扩增产物30 μL，rTaq酶05 μL，补水至50 μL，72℃ 40 min.
123PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收，回收片段克隆到pGEMT easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定及测序.
124pcDNA31(+)flagcbl真核表达载体的构建用BglI先将pGEMT easy酶切成小片段，因flagcbl内部无BglI酶切位点，故包含在酶切后产生的最大片段内，将该片段回收后再用KpnⅠ/XhoⅠ将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体中，构建出重组表达载体pcDNA31(+)flagcbl.
125基因转染COS7细胞在含100 mL/L新生小牛血清的1640 培养基中，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度下培养，80%汇合时按照LipofectamineTM2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染.
126Western blot检测转染后细胞中转入基因的表达分别于转染后24，48 h收细胞并裂解细胞内总蛋白，取20 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳并电转移至NC膜，5 g/L脱脂奶封闭1 h，分别与适当稀释后的一抗孵育1 h、PBST洗膜，然后与1∶4000二抗孵育1 h，PBST洗膜后加入发光底物孵育1 min，暗室中用X光片曝光，显影，定影.
2结果
21人cbl基因的克隆及序列测定用PCR技术以pEFHAcbl 质粒为模板扩增得到2737 bp片段（Fig 1），加“A”后克隆到pGEMT easy载体中，EcoRI/XhoI酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示切出大小为450、1190和3000 bp的几种片段（Fig 2），表明系阳性克隆，测序结果表明，所克隆的人cbl基因序列以及flagcbl融合基因的读框完全正确.
22真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl的构建利用酶切后产生的载体和片段之间互补的黏性末端进行亚克隆.构建成功的pGEMT easy flagcbl先用BglⅠ 将pGEMT easy酶切成小片段，而flagcbl内部无BglⅠ酶切位点，包含在最大片段内，将该片段回收后再用KpnI/XhoⅠ双酶切将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体.KpnⅠ/XhoⅠ双酶切和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定均表明pcDNA31(+)flagcbl表达载体构建成功（Fig 3）.
23真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl在COS7细胞中的表达构建成功的pcDNA31(+)flagcbl和空质粒pcDNA31(+)分别瞬时转染COS7细胞，转染后24 h和48 h antiflag抗体均检测到flagcbl在蛋白水平的表达，Mr约为120×103；而对照的空质粒转染后则没有相应的条带（Fig 4）.表明所构建的真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl 可以在真核细胞内正确表达.
3讨论
Cbl家族蛋白属于泛素连接酶E3家族的一大类，这类分子中具有RING结构域，又称为RING型E3 .遗传和进化研究显示，Cbl家族蛋白是一类保守的蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号通路的负调控因素.这一现象最早是在对C. elegans研究中发现的，功能缺失的Cbl同源分子Sli1可以恢复EGFR同源分子Let23的信号转导，而增加Sli1基因的拷贝数则可抑制此通路［4］；对Drosphila的研究也发现DCbl同样可负调控EGFR介导的信号通路［5］.此后，越来越多的研究表明，CCbl可以促进多种受体型蛋白酪氨酸激酶（RTK）如EGFR、PDGFRα、β［6］、CSF1R［7］等发生配体诱导的泛素化和随后的蛋白酶体降解.Cbl的这种负调控RTK作用对于维持正常细胞内稳机制具有重要意义.而上述分子很多在肿瘤的发生和过程中具有重要作用，有些是癌基因的产物；并且许多肿瘤细胞内与增殖有关的RTK发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.这就提示，加强Cbl分子的负调控作用机制，下调某些肿瘤细胞内过度活化或发生突变的RTK可能会抑制相应肿瘤的恶性增殖.已有研究表明CCbl不仅可以使细胞表面的Neu迅速泛素化、下调，并抑制其下游信号通路，而且可以抑制转染了Neu的神经母细胞瘤在小鼠体内的生长［8］.与此相一致，Klapper等认为HER2单抗Heceptin的抗癌机制与Cbl结合并促使HER2泛素化、降解有关［9］.另外，膜锚定的Cbl可以逆转由Hck导致的鼠成纤维细胞恶性转化，表现为细胞形态的改变以及锚着非依赖性生长受抑［10］.在鼠NIH3T3细胞中过表达Cbl可抑制PDGFα和PDGFβ诱导的细胞增殖及抵抗凋亡［6］.这些研究结果强烈地提示： Cbl可能能够抑制各种增殖性疾病（包括肿瘤在内）的细胞内多条信号通路，有可能将其作为与异常活化PTK相关疾病的手段.
我们以pEFHAcbl 质粒为模板，通过PCR法获得了N－末端融合有flag标签的人cbl基因，并构建了的flagcbl基因的真核表达载体，该表达载体在真核细胞COS7中能够正确表达.这为我们进一步研究cbl对肿瘤细胞生长的影响，探讨一种肿瘤治疗的新思路奠定了基础.
【】
［1］ Joazeiro C, Wing S, Huang H, et al. The tyrosine kinase negative regulator cCbl as a RINGtype, E2dependent ubiquitinprotein ligase ［J］. Science, 1999 ;286(5438):309-312.
［2］ Thien CB, Langdon WY. Cbl: Many adaptations to regulate protein tyrosine kinases［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001;2(4):294-307.
［3］ Peschard P, Park M. Escape from Cblmediated downregulation: A recurrent theme for oncogenic deregulation of receptor tyrosine kinases［J］. Cancer Cell, 2003 ;3(6):519-523.
［4］ Jongeward GD, Clandinin TR, Sternberg PW. Sli1, a negative regulator of let23mediated signaling in C. elegans［J］. Genetics, 1995;139(4):1553-1566.
［5］ Pai LM, Barcelo G, Schupbach T. Dcbl, a negative regulator of the Egfr pathway, is required for dorsoventral patterning in Drosophila oogenesis［J］. Cell, 2000;103(1):51-61.
［6］ Miyake S, MullaneRobinson KP, Lill NL, et al. Cblmediated negative regulation of plateletderived growth factor receptordependent cell proliferation. A critical role for Cbl tyrosine kinasebinding domain［J］. J Biol Chem, 1999;274(23):16619-16628.
［7］ Lee PS, Wang Y, Dominguez MG, et al.The Cbl protooncoprotein stimulates CSF1 receptor multiubiquitination and endocytosis, and attenuates macrophage proliferation［J］. EMBO J, 1999;18(13):3616-3628.
［8］ Levkowitz G, Oved S, Klapper LN, et al. cCbl is a suppressor of the neuoncogene［J］. J Biol Chem, 2000;275(45):35532-35539.
［9］ Klapper LN, Waterman H, Sela M, et al. Tumorinhibitory antibodies to HER2/ErbB2 may act by recruiting cCbl and enhancing ubiquitination of HER2［J］. Cancer Res, 2000;60(13):3384-3388.
［10］ Howlett CJ, Robbins SM. Membraneanchored Cbl suppresses Hck proteintyrosine kinase mediated cellular transformation［J］. Oncogene, 2002;21(11):1707-1716.
