黄芪甲甙体外抗乙型肝炎病毒的作用

             作者：张娟，陈建宗，张金平，贾新，蒋蔚峰     

【摘要】  　　目的： 探讨黄芪甲甙对乙型肝炎病毒（HBV）的体外抑制作用. 方法： 以HepG2.2.15细胞株为细胞模型,分别加入不同浓度的黄芪甲甙和拉米夫定，于培养第3，6和9日收集培养上清液. 通过MTT法观察药物对HepG2.2.15细胞株的影响，采用ELISA法及荧光定量PCR法，分析药物对细胞培养上清液中HBsAg ，HBeAg及HBV DNA含量的影响. 结果： 黄芪甲甙具有一定程度的抗HBV的作用. 黄芪甲甙给药9 d，其HBsAg 的50％抑制浓度（IC50）为22.1 mg/L，指数（TI）为4.4；HBeAg的IC50为26.2 mg/L ，TI为3.72；细胞外HBV DNA的IC50为13.2 mg/L，TI 为7.4. 拉米夫定也有抑制HBV的作用，但抑制作用较弱. 结论： 黄芪甲甙体外对HBV有抑制作用.

【关键词】  黄芪甲甙；HepG2.2.15细胞；肝炎表面抗原，乙型；肝炎e抗原，乙型；肝炎病毒，乙型

　    【Abstract】AIM:  To study the inhibitory effect of astragaloside IV  on hepatitis B virus (HBV)　 replication in vitro.  METHODS: Different concentrations of  astragaloside IV and  lamivudine in DMEM were added to the wells with the monolayer growth of HepG2.2.15 cells and the supernatant was collected at day 3,  6 and 9. The cytotoxic activity of drugs on HepG2.2.15 cells was detected by means of MTT. The concentrations of HBsAg and HBeAg in the culture supernatant were determined by enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA)   and the extracellular HBV DNA was measured by real?time PCR.  RESULTS:  When administrated for 9 d, astragaloside IV produced dose?dependent inhibition of HBsAg and HBeAg excreted by HepG2.2.15 cells, with a 50% inhibitory concentration（IC50）of 22.1 mg/L and 26.2  mg/L, respectively, and selectivity index（TI）was  4.4 and 3.72, respectively. Astragaloside IV reduced extracellular HBV DNA replication in HepG2.2.15 cells, with IC50 of 13.2 mg/L and TI  was  7.4. The inhibition rate of astragaloside IV  against HBV DNA was higher than that of lamivudine 　        5  mg/L.  CONCLUSION: Astragaloside IV has a dose?dependent inhibitory effect on replication  of human HBV in vitro.

    【Keywords】 astragaloside IV; HepG2.2.15 cell; hepatitis B surface antigens; hepatitis B e antigens; hepatitis B virus

　　 0引言

    乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）的感染会导致急慢性乙型肝炎的发生，是引起肝硬化、肝细胞癌的重要因素之一. 目前临床尚无治疗乙肝的特效药物. 黄芪甲甙是从黄芪等中草药中提取分离的单体化合物，也是黄芪制剂质量优劣衡量指标［1-2］.  新近的研究发现，黄芪甲甙具有抗炎、抗病毒作用，对HBV HBsAg阳性转阴也具有一定作用［3-4］. 为了探讨黄芪甲甙对HBV的抑制作用，本实验以HepG2.2.15细胞株为模型，研究不同浓度黄芪甲甙对HBsAg和HbeAg以及HBV DNA含量的影响.

    1材料和方法

    1.1材料黄芪甲甙（批号：110781?200512，北京药品生物制品检定所）. 拉米夫定（国药准字H20030581，苏州葛兰素史克制药有限公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国 Gibco公司）；谷氨酰胺、G418、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；L?谷氨酰胺（美国 Hyclone公司）；HBsAg，HBeAg 诊断试剂盒（上海华美生物工程公司）；HBV DNA荧光定量PCR试剂盒(广州 中山大学达安基因股份有限公司). ELX800酶标检测仪（美国宝特公司）；ABI Gene Amp5700自动荧光定量检测仪（美国Applied Biosystem公司）；HepG2.2.15细胞株（第四军医大学唐都传染病科）.

    1.2方法

    1.2.1药物的配制黄芪甲甙和拉米夫定分别用DMSO溶解为无色透明的液体. 黄芪甲甙用培养液稀释，配制成100，50，25和12.5 mg/L共4个浓度梯度；拉米夫定用培养液稀释到5 mg/L，并分别用50 g/L NaHCO3或1 mol/L HCL调整pH值为7.0～7.2，然后过滤除菌备用.

    1.2.2细胞培养用含150  mL/L胎牛血清，380 mg/L G418，100 mg/L青、链霉素及4 mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养液培养细胞，50 g/L NaHCO3调整pH值到7.2. 用2.5 g/L胰蛋白酶消化，每10日传代1次.取对数生长期状态良好的细胞，消化为单个细胞悬液,调整细胞数为4×109/L，接种于96孔板，每孔150 μL,于37℃，50 mL/L CO2培养箱培养48 h，待细胞贴壁后进行试验. 实验组加入含不同浓度黄芪甲甙的培养液，每一浓度设8个复孔，同时设浓度5 mg/L拉米夫定为阳性对照和仅加细胞培养液的阴性对照.每3日换同浓度药液1次，药物干预第3，6和9日时吸取上清液置于-20℃保存待用.

    1.2.3药物对细胞的毒性试验药物干预9日时吸取上清液，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL, 37℃,  50 mL/L CO2培养4 h，终止培养,吸弃孔内培养液后每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min ，在酶标仪上选择490 nm波长，测定各孔A值.细胞抑制率, 按下列公式计算半数毒性剂量（TC50）［5］. 细胞抑制率（％）＝［（细胞对照组平均A值-实验组平均A值）/细胞对照组平均A值）］×100％. TC50＝Anti log ［B+(50-50%抑制百分率)×C/>50%抑制百分率-<50%抑制百分率］(A=log＞50％药物浓度，B=log＜50％药物浓度,C=A-B ).

    1.2.4HBsAg和HBeAg测定使用ELISA法检测培养上清中的HBsAg或HBeAg，操作方法按试剂盒说明书进行.显色反应完成后选用450 nm波长在自动酶标仪上读取各孔A值.计算抗原抑制率，按下列公式计算50％药物抑制剂量(IC50). 抗原抑制率(%)=［（细胞对照组平均A值-实验组平均A值）/细胞对照组平均A值］×100％. IC50＝Anti log［B+(50-50%抑制百分率)×C/>50%抑制百分率-<50%抑制百分率］( A=log＞50％药物浓度，B=log＜50％药物浓度,C=A-B).

    1.2.5HBV DNA 检测按照Taqman荧光定量PCR试剂盒使用说明书操作.上游引物序列：5′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3′；下游引物序列：5′ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3′；荧光探针序列为：FAM?5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG ?3′?TAMRA. 取上清液40 μL,加等量DNA提取液混匀，沸水浴10 min，4℃静置8～12  h. 12 000 g离心5 min,取上清液5 μL做PCR反应.反应条件为：93℃  2 min预变性，然后93℃ 45 s到55℃ 1 min循环扩增10个循环，再按93℃ 30 s到55℃ 45 s循环扩增，做30个循环.反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果. 计算HBV DNA抑制率. HBV DNA抑制率（％）＝（阴性对照组HBV DNA拷贝数-实验组HBV DNA拷贝数）/阴性对照组HBV DNA拷贝数×100%.

    1.2.6治疗指数（TI）的计算HBsAg，HBeAg和HBV DNA的TI= TC50/IC50.当TI ＞2为有效低毒；1＜TI, ＜2为低毒有效；TI＜1为毒性作用.

    统计学处理： 实验资料以x±s表示，采用GraphPad Prism 4 Deme统计分析软件，对组间实验数据进行单因素方差分析及LSD?t检验，P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1药物对细胞的毒性作用结果显示，黄芪甲甙对细胞的毒性作用非常小，其100和50 mg/L黄芪甲甙对HepG2.2.15细胞的抑制率分别为50.6%和35.1%, TC50为97.4 mg/L. 拉米夫定在浓度为5 mg/L时对细胞生长未见明显毒性.

    2.2药物对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用黄芪甲甙不同浓度对HBsAg和HBeAg分泌均有一定抑制作用且随剂量的增加、时间的延长抑制作用也随之增加. 黄芪甲甙不同浓度对HBsAg和HBeAg抑制率：在实验第6日为74.6～26.5%和62.0～26.7%,在实验第9日为63.0～33.7和75.1～38.0，与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01，表1,2).  HBsAg IC50第6日值为53.5 mg/L ，第9日值为22.1 mg/L, TI>2；HBeAg IC50值第6日为59.4 mg/L ，第9日为26.2 mg/L，TI>2. 拉米夫定在浓度为5 mg/L时抑制HBV 分泌抗原能力较弱表1黄芪甲甙，拉米夫定对HBsAg抑制作用夫定

    2.3药物对HBV DNA分泌的抑制作用黄芪甲甙表2黄芪甲甙，拉米夫定对HBeAg抑制作用不同浓度对HBV DNA的分泌均有一定的抑制作用. 黄芪甲甙不同浓度对HBV DNA的抑制率：在实验第6日为62.0～26.7％，在实验第9日为85.3～48.9％，与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01，表3）. HBV DNA的IC50值第6日为39.9 mg/L ，第9日为13.2 mg/L,TI>2. 拉米夫定在浓度为5  mg/L时对HBV DNA也有一定程度的抑制作用，其在第6日和第9日对HBV DNA抑制率分别为15.9%和34.3%.表3黄芪甲甙，拉米夫定对 HBV DNA 的抑制作用

    3讨论

    黄芪甲甙是我国具有自主知识产权的一种黄芪皂甙类有效单体成分.实验发现，它对柯萨奇B3病毒有明显的抑制作用［4］. HepG2.2.15细胞是用完整的乙肝基因转染HepG2细胞而来,能稳定的分泌HBsAg, HBeAg, HBV DNA及Dane颗粒，是体外筛选抗HBV药物良好的细胞模型.本实验采用的HepG2.2.15细胞株，经传代培养，存活良好，并能大量的分泌HBsAg, HBeAg和HBV DNA，说明此细胞株在本实验中比较稳定.我们通过ELISA法和荧光定量PCR法测定黄芪甲甙对上清液中HBsAg和HBeAg表达的抑制作用和HBV DNA含量的影响,结果表明：不同浓度的黄芪甲甙对细胞上清液中HBsAg, HBeAg和HBV DNA均有不同程度的抑制作用.有研究证明，拉米夫定在浓度为5 mg/L时对HepG2.2.15细胞内的HBV DNA抑制作用最明显［6-7］,我们把浓度为5 mg/L的拉米夫定作为阳性对照，在实验第6日及第9日，发现黄芪甲甙对上清液中HBsAg, HBeAg和HBV DNA分泌的抑制作用明显强于拉米夫定.

    　　黄芪为豆科多年生草本植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的根，含有皂甙、多糖、黄酮、氨基酸和十几种微量元素等多种成分.近几年研究发现，黄芪中含有多种抗病毒成分.王志洁等［8］发现，黄芪总多糖抗人疱疹病毒的作用；邹宇宏等［9］研究发现有黄芪总甙抗HBV和抑制HepG2.2.15细胞增殖作用.本实验证明了，黄芪甲甙对HBsAg, HBeAg和HBV DNA有不同程度的抑制作用且与浓度成正相关，说明黄芪甲甙在体外有一定的抗HBV的作用.我们推测黄芪甲甙对HBV抑制可能是通过抑制HepG2.2.15细胞增殖或病毒DNA复制实现的. 虽然，我们通过体外实验证明了这一观点,但黄芪甲甙抗病毒的确切机制还有待进一步研究.

【】
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