间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定
【摘要】 目的： 针对间皮素（MSLN）构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装，探讨MSLN功能. 方法： 根据MSLN基因信息,用慢病毒质粒载体pRNAT?U6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒，转染OVCAR?3细胞后，检测RNA干扰效率，选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装，并检测病毒滴度，用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的影响. 结果： 测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确. 脂质体转染重组慢病毒质粒pRNAT?siRNA3的RNA干扰效率最高,为67.5%. 鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度为1×108 ifu/mL. pRNAT?siRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%，pRNAT?siRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为（15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组 (30.0±5.8)%，差异均有统计学意义 (P＜0.05). 结论： pRNAT?siRNA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR?3细胞MSLN表达以及粘附能力. MSLN RNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步研究MSLN功能和用慢病毒进行基因建立了一个良好的平台.
【关键词】 间皮素；慢病毒属；RNA干扰；卵巢肿瘤；细胞粘附
Construction and identification of a recombinant lentiviral vector of RNA interference of mesothelin gene
WANG Li, WU Xiao?Hua, LI Na
Department of Obstetrics and Gynaecology, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China
【Abstract】 AIM: To construsct a recombinant lentivirus plasmid of RNA interference of mesothelin gene. METHODS: According to the GenBank information of mesothelin, three interfering sequence and a negative sequence were designed and inserted into plasmid pRNAT?U 6.2/Lenti. OVCAR?3 cell was transfected and detected by real?time PCR. The plasmid with the highest interfering efficiency was packaged by packaging plasmid mix.The titer of virus was tested. OVCAR?3 cells were infected by lentivirus , and its adhesive ability was detected. RESULTS: DNA sequencing showed that the sequence of recombinant lentivirus plasmid was correct. The plasmid with the highest interfering efficiency was pRNAT?siRNA3, and the interfering efficiency was 67.5%. The titer of virus was 1×108 ifu/mL. The interfering efficiency of lentivirus was 78%. Cell adhesion tests showed that OVCAR?3 cells infected by pRNAT?siRNA3 lentivirus adhered less effectively to matrigel (15.1±1.3)% than control groups［(33.4±8.2)%,(30.0±5.8)%,(P＜0.05)］. CONCLUSION: Infection of pRNAT?siRNA3 lentivirus significantly inhibits mesothelin expression and cell adhesion.The successful construction of lentivirus vector of RNA interference of mesothelin gene lays a foundation for further study of the function and gene therapy of mesothelin.
【Keywords】 mesothelin; lentivirus; RNA interference; ovarian neoplasms; cell adhesion
0引言
间皮素（mesothelin, MSLN）是一种近年发现的肿瘤相关抗原，通常仅表达在胸膜腔、腹膜腔和心包腔的间皮细胞，但在恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤中过表达. MSLN可能是CA125的配子，两者共同参与细胞粘附，并且具有很高的亲和力，与卵巢癌的腹腔种植有关，并参与肿瘤转移［1］. 但迄今为止，有关MSLN功能研究的报道还很少见. 本研究旨在通过针对MSLN的RNA干扰(RNA interference RNAi)重组慢病毒载体的构建和慢病毒包装，以探讨MSLN的粘附功能和利用慢病毒进行基因治疗的可能性.
1材料和方法
1．1材料人卵巢浆液性囊腺癌细胞系OVCAR?3由河北医科大学第四科研中心提供. 人胚肾293T细胞购自中科院细胞库. 慢病毒质粒pRNAT?U6.2/Lenti（美国Genscript公司）；质粒抽提试剂盒（美国Axygen公司，德国Qiagen公司）；转染试剂LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）；慢病毒包装试剂盒pPACKH1? Lentivector Packaging Kit（美国SBI公司）；小干扰序列和引物由上海生工合成；低分子量蛋白Marker，蛋白质提取试剂盒等（北京赛百盛生物公司）；检测用抗体： MSLN鼠抗人mAb K1(美国ZYMED公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多抗,β?actin抗体(中杉金桥生物公司)；人工基底膜材料Matrigel(美国BD公司).
1．2方法
1.2.1RNAi慢病毒质粒载体的构建及测序根据MSLN（NM_005823）基因信息，设计siRNA1,siRNA2,siRNA3三条针对MSLN基因的RNAi序列，同时设计一条阴性（negative）序列用于对照组实验，均通过BLAST软件验证. 四条序列如下① negative：TTCTCCGAACGTGTCACGT；② siRNA1：TGTCAAGCTCTCAACAGAG；③ siRNA2：GTGGAGAAGACAGCCTGTC；④ siRNA3：GCTCTCAACAGAGCAGCTG. 根据上述四条序列设计四对互补的单链DNA，互补单链中间连有loop环，两端为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的黏性末端，形成一条单链可直接与酶切后的载体进行连接反应. 设计好的序列送上海生工合成. 载体pRNAT?U 6.2/Lenti 的U 6.2启动子后的BamHⅠ（GGATCC）和XhoⅠ（CTCGAG）之间为插入位点. 用设计合成好的四条单链DNA片段构建四个质粒：pRNAT?negative，pRNAT? siRNA1，pRNAT? siRNA2和pRNAT? siRNA3，方法如下：将合成好的单链DNA进行稀释和退火，对空载体pRNAT?U 6.2/Lenti用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，将退火后稀释产物和回收好的双酶切载体进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌，使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落，挑取阳性菌落扩大培养后送上海生工测序，使用Qiagen质粒抽提试剂盒抽提去内毒素质粒用于后续细胞转染实验.
1.2.2筛选有效的干扰序列转染前1 d将细胞接种到6孔细胞培养板中，每孔接种1×106个细胞,待细胞密度为90%～95%时进行转染实验. 转染实验分为A组：空白对照；B组：只加LipofectamineTM 2000；C组：加质粒pRNAT?negative；D组E组和F组分别加三个干扰质粒. 按照LipofectamineTM 2000转染试剂盒说明进行操作，转染48 h后分别收集各孔细胞的RNA，进行后续的实时定量PCR实验. MSLN引物: F 5′CTGGAAGCCTGCGTGGAT 3′ R 5′CTCATTTCGTGCCCTTTGTTG 3′；反应体系如下：10× PCR缓冲液2.5 μL，MgCl2溶液3 μL，dNTP混合液3 μL，Taq聚合酶3 units，Sybergreen终浓度0.25×20 umol/L 的引物0.5 μL，cDNA 或DNA 1 μL，加水至总体积为25 μL. 反应条件如下: 94℃，4 min；35个PCR循环：94℃，10 s；57℃，15 s；72℃，20 s；86.5℃，5 s；为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃，每5 s升高1℃. 绘制标准曲线. 干扰效率（%）=基因表达下调比值%/转染效率%.
1.2.3慢病毒包装实验过程参照SBI的Lentivector Expression System的操作手册进行. 培养293T细胞株作为包装细胞,在脂质体介导下将2 μg pRNAT?siRNA3或pRNAT?negative同10 μg慢病毒包装质粒混合物转染到293T细胞，收集转染后24 h和48 h的上清液,将含有慢病毒颗粒的上清离心并用Millex?HV 0.45 μm的PVDF滤膜过滤，待测病毒液和标准病毒液做梯度稀释分组,同时转染293T细胞，测定病毒液滴度.
1.2.4检测慢病毒的RNA干扰效率OVCAR?3细胞密度为90%～95%，进行转染实验；分为A组：pRNAT?siRNA3慢病毒干扰组；B组：pRNAT?negative慢病毒阴性对照组；C组：空白对照组. 三组加入培养基1 mL/孔，再分别加入培养基或病毒液各100 μL（相当于MOI值为10. MOI值是感染一个细胞所需的病毒颗粒数），培养48 h后收集各孔细胞的RNA和总蛋白，实时定量PCR实验操作方法如1.2.2. Western Blot 检测蛋白质表达：用蛋白质提取试剂盒提取培养细胞的总蛋白，考马斯亮蓝检测试剂盒蛋白定量，120 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳，4℃冷库恒流，150 mA 3 h电转移至PVDF膜，奶粉封闭后加入1∶200稀释间皮素鼠抗人mAb K1或1∶1000稀释β?actin 4℃过夜，漂洗后1∶2000辣根过氧化物酶标记羊抗鼠多抗37℃ 2 h，DAB试剂盒显色.
1.2.5人工基底膜成分的粘附性实验50 μg/mL Matrigel，10 g/L牛血清白蛋白（BSA）或300 μg/mL多聚赖氨酸100 μL/孔加入96孔平底培养板，每个时相点设4个复孔，37℃孵育2 h，用PBS洗涤2遍；10 g/L BSA 100 μL/孔，37℃孵育0.5 h，用PBS洗涤2遍备用；调整细胞浓度为4×105/mL，每孔加入细胞悬液100 μL，37℃孵育2 h，用PBS洗涤2遍，去除未粘附细胞， MTT法检测粘附率,酶标仪570 nm波长处测定吸光度(A值)；以多聚赖氨酸和BSA预包被者为最大最小值，A,B,C三组细胞对基质成分粘附的相对百分率. 粘附率（%）=(样品A值-BSA孔A值)/( 多聚赖氨酸孔A值- BSA孔A值)×100%.
统计学处理： 采用SPSS 11.5软件进行统计分析,计量资料采用单因素方差分析, P＜0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2．1慢病毒质粒载体的鉴定阳性菌落提取质粒DNA，PCR扩增片段为321 bp或322 bp为载体构建成功的阳性菌落（图1）. 四种序列慢病毒质粒载体测序结果证明了四种重组慢病毒质粒载体的插入序列与设计序列一致，没有碱基缺失或替换等（图2），提示慢病毒质粒构建成功.
2．2在OVCAR?3细胞中RNA干扰序列的筛选慢病毒质粒转染各组OVCAR?3细胞后荧光细胞的数量均在40%左右，说明转染效率为40%. 实时定量PCR检测扩增曲线和标准曲线见图3. B组，C组，D组，E组和F组OVCAR?3细胞中MSLN的mRNA表达量同对照组A组细胞相比分别下调了11%, 8%, 22%, 3%和27%；pRNAT?siRNA1，pRNAT?siRNA2，pRNAT?siRNA3的干扰效率分别为：55%，7.5%和67.5%，pRNAT?siRNA3的干扰效率最高.
2．3慢病毒的生产和鉴定重组慢病毒质粒pRNAT?siRNA3和慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞24 h后的绿色荧光强度高，细胞生长良好，表明病毒包装成功（图4）. 病毒液过滤浓缩后测定病毒滴度为1×108 ifu/mL，滴度高符合后续实验的要求.
2．4慢病毒RNA干扰效率鉴定慢病毒感染OVCAR?3细胞48 h后，观察A组，B组OVCAR?3细胞中荧光细胞的数量，转染效率为80%～82%，明显高于脂质体的转染效率. 实时定量PCR检测A组，B组的OVCAR?3细胞中MSLN基因的mRNA表达量同C组细胞中的表达量相比下调了64%，5.5%，pRNAT?siRNA3的mRNA干扰效率为78%，比脂质体转染的干扰效率增加. 三组细胞提取蛋白Western Blot检测,在Mr相当于40×103处均有不同程度特异性条带的表达，A组蛋白表达明显低于B组和C组(P<0.05)，B组，C组之间蛋白表达没有明显差异（P>0.05, 图5）.
2．5RNA干扰后OVCAR?3细胞粘附性的变化A组B组和C组三组细胞的平均粘附率分别为(15.1±1.3)%,(33.4±8.2)%和(30.0±5.8)%,转染RNA干扰病毒的A组细胞粘附率明显低于其他两组 (P<0.05),而B组和C组相比粘附率差异无统计学意义(P>0.05). 说明MSLN蛋白表达降低后, OVCAR?3细胞对人工基底膜材料Matrigel的粘附性下降.
3讨论
MSLN的研究在国内刚刚起步，目前仅有关于胰腺组织表达的研究报道［2］. 国外MSLN的研究主要集中在作为肿瘤标志物和抗体靶向两个方面, 认为MSLN可作为一种新的肿瘤标志物用于上皮性卵巢癌的筛查和预后监测指标［3］，同时在抗体靶向治疗动物实验方面也取得了初步成功［4］. 而MSLN的功能研究进展的较为缓慢，与其他粘附分子之间的关系尚不明确. 吴小华等［5］的研究已证实卵巢上皮性肿瘤组织中MSLN和CA125表达有显著的一致性，在浆液性卵巢癌和子宫内膜样卵巢癌组织中表达显著高于黏液性癌.
本研究设计了MSLN的三个干扰序列和一个阴性对照序列，成功构建了四个慢病毒质粒，转染后证实重组慢病毒质粒pRNAT?siRNA3的干扰效率较高. 该慢病毒载体带有氨卞西林，G418筛选标记和GFP荧光蛋白标记，在没有慢病毒包装之前的脂质体转染效率较低，仅有40%左右，但在慢病毒包装之后，感染细胞的效率可以增加到80%,而且mRNA干扰效率也显著提高. 有研究表明，以人免疫缺陷病毒(HIV?1)为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞［6］，目的基因随病毒整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，能够同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达以及生物的安全性，已成为更为理想的基因转移载体. 因此这种慢病毒载体除了可以感染肿瘤细胞外，还可以感染腹膜间皮细胞干扰其间皮素表达，对研究卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞之间的相互作用十分有利.
利用RNA干扰慢病毒转染OVCAR?3卵巢癌细胞后发现，随着MSLN表达的下降，OVCAR?3细胞对细胞外基质的粘附性明显降低，说明MSLN蛋白不仅仅依赖于CA125而可能单独参与细胞粘附，但卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞之间种殖粘附的关系还需要进一步的体内实验来证实.
用这种慢病毒载体筛选出稳转细胞株后进行MSLN的功能研究非常方便，可进行长时间的观察和动物实验，建立MSLN基因沉默的卵巢癌动物模型，可以用慢病毒进行基因治疗研究. MSLN RNAi慢病毒载体的制备成功为进一步研究MSLN建立了一个良好的平台.
【】
［1］ Gubbels JA, Belisle J, Onda M, et al. Mesothelin?MUC16 binding is a high affinity, N?glycan dependent interaction that facilitates peritoneal metastasis of ovarian tumors［J］. Mol Cancer, 2006，5(1):50-58.
［2］ 滕丽萍，胡静静，袁庆新，等. 大鼠胚胎发育后期胰腺中Mesothelin的表达［J］. 第四军医大学学报,2005，26(17):1570-1572.
［3］ Huang CY, Cheng WF, Lee CN, et al. Serum mesothelin in epithelial ovarian carcinoma: A new screening marker and prognostic factor［J］. Anticancer Res, 2006,26:4721-4728.
［4］ Filpula D, Yang K, Basu A, et al. Releasable PEGylation of mesothelin targeted immunotoxin SS1P achieves single dosage complete regression of a human carcinoma in mice［J］. Bioconjug Chem, 2007,18(3):773-784.
［5］ 吴小华，王小玲，张立芳，等. 卵巢上皮性肿瘤组织中间皮素和CA125表达及相关性研究［J］. 中华妇产科杂志,2005，40(10):709-711.
［6］ Rubinson DA, Dillon CP, Kwiatkowski AV, et al. A Lentivirus?based system to functionally silence genes in primary mammalian cells ,stem cells and transgenic mice by RNA interference［J］. Nat Genet，2003，33(3): 401-406.
