蜂毒素对肝癌细胞BEL?7402的增殖抑制作用

              作者：张晨 李柏 黄雪强 张亚妮 苏永华 凌昌全

【摘要】  ［目的］观察蜂毒素对肝癌细胞BEL?7402的增殖抑制作用。［方法］肝癌细胞BEL?7402体外培养，采用MTT法检测蜂毒素对其增殖抑制作用，流式细胞术测定蜂毒素对细胞增殖核抗原表达和细胞周期的影响。［结果］蜂毒素体外能够抑制BEL?7402肝癌细胞的增殖活性；并抑制细胞增殖核抗原的表达，呈剂量依赖性；干扰细胞周期，使S期细胞增加，G2/M期细胞减少。［结论］蜂毒素具有抑制BEL?7402肝癌细胞增殖的作用，机制可能与抑制细胞增殖核抗原表达和干扰细胞周期有关。

【关键词】  蜂毒素；肝细胞癌；增殖；细胞增殖核抗原；细胞周期

　　Abstract: ［Objective］To study the inhibition of melittin on proliferation of hepatocellular carcinoma cell line BEL?7402. ［Methods］BEL?7402 cell line was cultured in vitro, and treated with melittin. The proliferation inhibition was detected by MTT assay, The expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and cell cycle phase were detected by flow cytometry.［Results］ Melittin cound significantly inhibit the growth of BEL?7402 and block up cells progress through G2/M. The percentage of PCNA positive cell was decreased gradually when concentration of melittin was increased.［Conclusions］ Melittin cound inhibit the proliferative activity of hepatocellular carcinoma cell line BEL?7402 and reduce of PCNA positive cell expression and arrest cells in S phase.

　　Key words: Melittin; hepatocellular carcinoma; proliferation; proliferating cell nuclear antigen; cell cycle phase
   
　　蜂毒素是蜜蜂毒的主要成分，既往我们实验室对蜂毒素的提取、纯化及抗肿瘤作用进行了多年研究，探索了一些提取、纯化蜂毒素的方法［1?2］，初步发现蜂毒素抗肿瘤起效快、作用强［3?7］。在此基础上，本实验进一步观察蜂毒素对肝癌细胞BEL?7402的增殖抑制效果及作用机制，为蜂毒素抗肿瘤的临床应用提供部分实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  药物  蜂毒素为长海中医科实验室通过AKTA蛋白纯化工艺开拓系统层析提取、纯化，冷冻干燥后分装备用。

　　1.1.2  细胞株  人肝癌细胞株BEL?7402由长海医院中医科实验室保存，用含10%小牛血清的RPMI?1640完全培养基，在37℃、体积分数为5%CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，取对数生长期细胞进行实验。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  增殖抑制率测定  BEL?7402细胞以1.5×104/孔接种于96孔板，培养24h细胞贴壁后，实验组加入终浓度为2、4、8、16、32、64及128μg的蜂毒素培养12h和24h，每孔加MTT 20ml继续培养4h，倾去培养基，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150ml，震荡混匀，10min后于酶联仪上以波长490nm测定光密度值，按下列公式细胞增殖抑制率：
   
　　细胞增殖抑制率=（1?实验组光密度值/对照组光密度值）×100%

　　1.2.2  增殖核抗原的检测  取指数生长期BEL?7402细胞，以5×105细胞/孔接种于6孔培养板中，每孔体积分数为2ml，常规培养24h细胞贴壁后，分别加入不同浓度的蜂毒素处理细胞，另设空白对照，每组设3个复孔，于处理后24h，收集细胞，离心，PBS洗涤2次，用70%冷乙醇2ml（4℃）固定，经1500转离心5min，弃去乙醇，PBS洗涤2次，用终浓度为0.02%的Triton X?100预处理20min后，用FITC标记的PCNA单抗直接染色，FITC标记的小鼠IgG2a作同型对照，流式细胞仪进行检测。

　　1.2.3  肝癌细胞周期的检测  碘化丙锭（PI）染液的配制：PI 50μg/ml，0.02％Triton X?100，Rnase 100μg/ml。BEL?7402细胞接种于培养瓶中，常规培养24h细胞贴壁后，分别加入32μg/ml和16μg/ml的蜂毒素，另设空白对照组。于处理后24h，收集细胞，70%乙醇固定，4℃过夜，PI染液避光染色30min，流式细胞仪测定各细胞周期所占百分比。

　　2  结果

　　2.1  不同浓度蜂毒素对BEL?7402肝癌细胞的增殖抑制率  见表1。蜂毒素体外对BEL?7402肝癌细胞的增殖有一定的抑制作用。

　　表1  蜂毒素对BEL?7402肝癌细胞的增殖抑制率（略）

　　2.2  不同浓度蜂毒素对BEL?7402肝癌细胞增殖核抗原的影响  见表2。不同浓度蜂毒素处理BEL?7402细胞后，可见各浓度组PCNA量均较对照组降低（P<0.01），并且呈现明显剂量依赖性特点。
   
　　表2  蜂毒素对BEL?7402细胞增殖核抗原的影响（略）

　　*P<0.05 vs对照组；**P<0.01 vs对照组。

　　2.3  不同浓度蜂毒素对肝癌细胞周期的影响  见表3。经蜂毒素处理后，肝癌细胞的细胞周期均受到不同程度的影响，S期细胞比例相对增多，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。

　　表3  蜂毒素对BEL?7402肝癌细胞周期的影响（略）

　　*P<0.01 vs对照组

　　3  讨论
   
　　恶性肿瘤细胞异常增殖是其特征之一，有效抑制肿瘤细胞的生长、增殖，是抗肿瘤药物的重要要求之一。本研究采用MTT法，评价本实验室采用中压液相色谱分离、纯化的蜂毒素的抗肿瘤生物活性。结果表明，蜂毒素在体外对肝癌细胞BEL?7402的增殖具有一定的抑制作用。
   
　　增殖性细胞核抗原又称周期蛋白（cyclin），首先由Miyachi提纯，其分子量在33 KD～36 KD之间，它是一种非组蛋白核内多肽，是DNA合成的特殊辅酶［8］，其含量反映了细胞增殖的程度。PCNA作为DNA聚合酶的复合因子，有调节DNA合成的功能，也可参与非程序化的DNA合成，在细胞增殖过程中有重要意义［9?10］。本实验采用流式细胞仪的方法测定了蜂毒素对肝癌细胞PCNA的影响，结果显示蜂毒素可减少肝癌细胞的PCNA表达，而蜂毒素对肝癌细胞的增殖抑制作用可能与其抑制PCNA的表达有关。
   
　　细胞周期是指细胞前一次分裂结束开始生长，到下一次分裂终了所有经历的过程，反映了细胞增殖分裂这一细胞最基本的生理活动。肿瘤的特征之一是细胞周期异常，使肿瘤细胞无限地增殖。细胞周期各时相的生化变化是一个连续的过程，细胞周期的任何一个时相的生物合成被阻断，都可使整个细胞周期中断，肿瘤的中心环节就是干扰肿瘤细胞的细胞周期，从而影响细胞的生长、增殖或诱导细胞凋亡的产生。
   
　　我们进行的体外研究表明，蜂毒素可以干扰肝癌细胞细胞周期的正常移行，将细胞阻滞于S期，并且呈剂量依赖性，造成大量的S细胞的堆积［4］。本实验结果显示，32μg/ml的蜂毒素对BEL?7402细胞周期的影响也表现为S期的阻滞。细胞的DNA在S期进行解旋、复制，大量细胞堆积于S期，使药物的作用于DNA的位点增加，易于引起基因表型的改变，从而影响细胞的代谢和功能。这与一般报道抗肿瘤药物多使细胞停滞于G0/G1期不再分裂增殖的结果不同，可能是由于不同药物对细胞周期作用的分子靶点不同有关。

【】
  　　［1］ 刘岭，胡晋红，凌昌全.蜜蜂毒中蜂毒素的分离纯化方法及含量测定［M］.第二军医大学学报，2001,22（7）:609?611.

　　［2］ 刘岭，凌昌全，黄雪强.蜂毒素的纯化方法及体外抗肿瘤作用研究［M］.生化药物杂志，2003,24（4）:163?166.

　　［3］ 凌昌全，黄雪强，刘岭，等.蜂毒素体外抑瘤作用的实验研究［M］.第二军医大学学报，2001,22（7）:612?614.

　　［4］ 陈永强，朱振安，郝永强，等.蜂毒素诱导骨肉瘤细胞U2OS凋亡与坏死的实验研究［M］.中西医结合学报，2004,2（3）:208?209.

　　［5］ 凌昌全，彭永海，张晨，等.蜂毒素对小鼠肝癌H22细胞增殖的影响［M］.中草药，2003,34（10）:921?923.

　　［6］ 李柏，凌昌全，张晨，等.蜂毒素基因重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的作用［M］.中华肝脏病杂志，2004,12（8）:453?455.

　　［7］ Ling CQ, Li B, Zhang C, et al. Inhibitory effect of recombinant adenovirus carring melittin gene on hepatocellular carcinoma［M］. Annals of Oncology, 2005, 16（1）: 109?115.

　　［8］ Bravo R, Frank R, Blindeu PA. Cyclin/PCNA is the auxiliary protern to DNA polymerase?delta［M］. Nature, 1987, 326（6112）: 515?517.

　　［9］ Jaskulski D, deRiel JK, Mercer WE, et al. Inhibition of cellular proliferation by antisense oligodeoxynucleotides to PCNA cyclin［M］. Science, 1988, 240（4858）: 1544?1546.

　　［10］ Kurki P, Vanderlaan M, Dolbeare F, et al. Expression of prdiferation cell unclear antigen （PCNA）/cyclin during the cell cycle［M］. Exp Cell Res, 1986, 166（1）: 209?219.