丙酯对缺氧性血管内皮细胞凋亡的保护作用

【摘要】  目的 研究?丙酯对缺氧性血管内皮细胞凋亡的影响。 方法 用氰化钠（NaCN）合并低糖DMEM培养液构建培养的人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304）缺氧模型;四唑盐法、丫啶橙/溴乙啶荧光染色、末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记等观察细胞受损和凋亡情况。 结果 NaCN合并低糖培养液可引起血管内皮细胞凋亡。4μg/mL?丙酯可显著减少由于NaCN引起的缺氧性内皮细胞凋亡（P<0.05）。结论 ?丙酯对缺氧条件下的ECV304细胞具有保护作用。

【关键词】  内皮，血管;脱噬作用;没食子酸丙酯

　血管内皮细胞具有广泛且重要的作用，内皮细胞损伤是动脉硬化发生和的早期事件，包括坏死和凋亡 ［1］ 。内皮细胞过度凋亡是血管病变发生发展的原因之一。近年研究发现动脉硬化斑块区可检测到大量凋亡内皮细胞，而非斑块区则无 ［2］ 。抑制内皮细胞凋亡、保护内皮功能的抗氧化剂药物将可以抑制血管内皮细胞凋亡、预防血管病变的形成，并具有作用 ［3］ 。?丙酯是经FDA和WHO批准使用的抗氧化剂，临床上现已用于血栓性疾病的治疗 ［4-5］ ，并在抗栓治疗中发挥着越来越重要的作用。但该药对于血管内皮细胞的作用机制尚不明了，笔者以氰化钠（NaCN）合并低糖培养液构建培养的人血管内皮细胞株（ECV304）组织细胞性缺氧模型，研究在缺氧条件下，?丙酯对ECV304细胞凋亡的影响，为其用于治疗新的适应症提供实验根据。
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 试剂与药品 注射用?丙酯由福建省闽东力捷迅药业有限公司提供;人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304）购自院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;高糖DMEM及低糖DMEM培养液为Gibco公司产品;四唑盐（MTT）为Ameresco产品;PI、EB购自Sigma公司;TUNEL试剂盒为Promega公司产品。
   
　　1.2 ECV304细胞培养 将ECV304细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养液接种于六孔培养板，置于37℃、体积分数0.05的CO 2 培养箱中培养，细胞约3d后长满。用0.25%胰蛋白酶消化传代。
   
　　1.3 缺氧损伤凋亡模型与实验分组 将培养细胞随机分成7组，待细胞生长达到80%融合时，分别加入等体积的?丙酯（溶剂为含10%胎牛血清的DMEM培养液）0，0.5，1，2，4，8，10μg/mL作用24h，观察细胞的生长状况，选择适宜的药物浓度。培养细胞生长至80%融合时，随机分组，模型组加入含10mmol/L NaCN及10%胎牛血清的低糖DMEM培养液;?丙酯组（缺氧前2h加入不同浓度?丙酯预培养）;对照组用含10%胎牛血清的DMEM培养液。将培养板置于CO 2 培养箱中，20h后取出进行检测。以60μg/mL阿司匹林作为阳性对照药。
   
　　1.3.1 四唑盐比色试验（MTT法）检测细胞活力 将细胞培养在96孔培养板上，接种量为2×10 4 ，待细胞生长至80%融合时，随机分组，各组设4个复孔。培养20h后，每孔加入MTT溶液（1mg/mL）100μL，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入DMSO150μL，振荡使结晶物充分溶解后于490nm波长处测定各孔光密度（D）并记录结果。
   
　　1.3.2 丫啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光染色观察细胞凋亡 AO、EB分别溶于pH7.2PBS中，配成100μg/mL储备液，用前等量混合。取细胞悬液100μL，加入染料4μL混匀，滴于载玻片上，直接在荧光显微镜下观察。镜下可见4种细胞:活细胞核染色质被染成绿色并呈正常结构，早期凋亡细胞核染色质着绿色并呈现固缩状或圆珠状，晚期凋亡细胞膜受损，核染色质染成桔红色并呈现固缩状或圆珠状，坏死细胞膜受损，核染色质染成桔红色并呈现正常结构。
   
　　1.3.3 末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测凋亡 DeadEnd  TM Col-orimetric TUNEL System系统使用一个改进的TUNEL来末端标记凋亡细胞的碎片DNA。使用末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）将生物素标记的核苷酸掺入到DNA的3'-OH末端。辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（streptavidin HRP）结合到这些生物素核苷酸上，后者可用过氧化物酶的底物过氧化氢和稳定的色素原联苯二胺（DAB）检测。凋亡细胞核苷酸被染成深棕色。各组分别计数1000个细胞，各组凋亡细胞数并进行比较。
   
　　1.4 统计学处理 每组试验重复3次，实验数据以均值±标准差表示，统计处理应用SPSS11.0进行方差分析，配对资料t检验。

    
　　2 结果
    
　　2.1 ?丙酯对ECV304细胞生长的影响作用 培养液中加入不同浓度的?丙酯后，当浓度为1～4μg/mL时细胞生长状况良好，在该浓度范围对细胞活力的影响具有剂量依赖性。<1μg/mL或>4μg/mL时，可见大量固缩、漂浮的细胞，提示细胞活力下降。本实验设定?丙酯浓度为1～4μg/mL。?丙酯2，4μg/mL对细胞增殖的作用强于阿司匹林（60μg/mL），?丙酯1μg/mL无效（表1）。

　　表1  ?丙酯对ECV-304细胞生长的影响（略）

　　与对照组比较，*:P<0.05.
    
　　2.2 ?丙酯对NaCN引起的细胞凋亡的保护作用

　　2.2.1 4μg/mL?丙酯对NaCN引起的内皮细胞凋亡具有显著的改善作用（表2）。
    
　　表2  ?丙酯对内皮细胞存活的干预作用（略）

　　与模型组比较，*:P<0.05.
    
　　2.2.2 AO/EB荧光染色观察可见?丙酯对NaCN引起的ECV304细胞凋亡的具有保护作用。正常对照组细胞略呈多角形，细胞体舒展，细胞核为椭圆形或类圆形，发黄绿色荧光，有时可见荧光较强的核仁;细胞质荧光为黄绿色。模型组细胞间见大量凋亡细胞及胞体缩小、核碎裂、核固缩等典型的凋亡形态改变。而给药组凋亡细胞与模型组比较明显减少，多数细胞形态接近正常（图1）。
   
　　2.2.3 TUNEL染色结果 给药细胞细胞核染成棕色，细胞数低于模型组。?丙酯（2μg/mL和4μg/mL）和阿司匹林药物干预均使凋亡比例下降（表3）。 

　　表3  各组TUNEL染色后的细胞凋亡比例（略）
    
　　各组细胞数1000.
    
　　3 讨论
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　　丙酯（曾用名通脉酯、赤芍801）由中药赤芍的活性成分没食子酸经酯化反应合成，因含有没食子酸丙酯而具有更强生物效应，为全新的化学合成单体药物。?

　　丙酯具有抗血小板聚集、抗炎、抗自由基、扩张血管和改变血液流变、改善微循环等作用，是心脑血管疾病较有前途的一种药物，而且具有比阿司匹林更强的抗血小板聚集作用 ［6-7］ 。
   
　　利用氰化物造成细胞缺氧的报道很多，因为氰化物可引起氧自由基的产生，降低细胞的抗氧化功能 ［8］ 。本实验采用10mmol/L NaCN的低糖DMEM培养液造成组织细胞性缺氧，模拟体内缺氧的情况，处理20h造成大量ECV304细胞凋亡。
   
　　人脐静脉血管内皮细胞株ECV304细胞形态和生化特征与原代培养的人脐静脉血管内皮细胞非常相似，是体外研究血管内皮细胞的良好模型，因此一直被人们广泛地用作实验研究 ［9］ 。但近年来也有人对上述看法表示异议，认为该细胞能不依赖血管内皮生长因子无限地长期传代，缺乏Von Wille-brand因子等内皮细胞特征性标志，故认为不是血管内皮细胞 ［10］ 。但是国内外仍有不少学者明确地将ECV304细胞作为血管内皮细胞使用 ［11-12］ 。本文结果显示，?丙酯能显著减少NaCN引起的组织细胞性缺氧导致的ECV304细胞凋亡。?丙酯（4μg/mL）对ECV304细胞凋亡的保护作用与阿司匹林（60μg/mL）的疗效接近，但前者的作用强度超过后者，且?丙酯对正常ECV304细胞还具有提高细胞活力的作用，阿司匹林则没有。相关的实验还证实，?丙酯是一种抗氧化剂，具有较强的清除氧自由基的作用 ［7］ 。动物实验发现，?丙酯对脑缺血再灌注所致的脂质过氧化损伤亦有保护作用，能提高缺血再灌注大鼠脑组织SOD、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，因此?丙酯的抗凋亡作用可能与其抗氧化作用有关。
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　　丙酯具有抗血小板聚集和干预ECV304细胞凋亡的作用，有利于维持ECV304细胞的功能，维持血液凝固稳定和减轻缺血后炎症反应，在临床血栓性疾病的治疗中具有积极意义，其干预凋亡的具体机制有待进一步研究。 

【】
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