苯巴比妥对癫?大鼠海马苔藓纤维突触重组和认知发育的影响
作者：陈燕惠 ，陈文雄 ，陈珊 ，郑耀辉 ，王丽
【摘要】 目的 探讨苯巴比妥（PB）对不同发育期癫?大鼠海马内苔藓纤维（MF）发芽与认知功能的影响。 方法 Wistar大鼠按出生后日龄分组（P5、P15、P25、P60），以红藻氨酸（KA）制备癫?模型，实验结束取脑制片，行Timm染色，观察海马齿状回内分子层染色改变。认知功能测验采用跳台法。 结果 KA致?对P5、P15组海马内MF发芽现象、大鼠学习记忆功能无明显影响，但可使P25、P60组大鼠海马内MF发芽现象加剧，伴学习、记忆成绩明显下降，PB可加剧这一现象。PB对未致?大鼠海马内MF发芽现象和学习记忆功能无明显影响。 结论 海马MF突触重组是PB影响不同发育时期癫?大鼠学习记忆功能的重要原因。
【关键词】 苯巴比妥;癫?;认知;苔藓纤维，海马;大鼠
癫?发作与抗癫?药物是影响癫?儿童认知功能的重要因素。神经纤维突触重组不仅对癫?的发生和具有十分重要的意义，而且对认知功能也有显著影响。笔者利用不同发育期大鼠红藻氨酸（KA）致?模型观察传统抗癫药苯巴比妥（PB）对海马内苔藓纤维（MF）发芽与认知功能的影响。
1 材料和方法
1.1 动物 雄性Wistar大鼠160只，购自北京大学动物部，恒温动物室分笼饲养，自由饮水，明暗周期12h/12h。大鼠按出生后日龄（P）5，15，25，60d分为4组（P5、P15、P25、P60），体质量分别为（15±2）、（35±4）、（50±6）、（180±20）g。
1.2 致?模型与分组 根据［1］，用KA（美国Sigma公司）制备癫?模型。根据致?与否以及药物将各年龄组大鼠分为A、B、C、D四组（n=10）:A、B组KA致?后分别注射生理盐水（NS）或PB;C、D组不致?分别注射PB或NS，均采用腹腔注射，1/d。PB（北京化工厂）60mg/kg，注射容积5mL/kg，连续给药15d。观察每日上午8∶00～12∶00大鼠行为。
1.3 学习记忆测验 采用跳台法即一次性被动回避性反射法，根据文献［2］方法设计。测试在用药第15d进行。测试时将大鼠放入跳台仪内，适应环境3min。调控电压36V，通电，大鼠受电击后跳上跳台逃避电击。跳下时以大鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应，训练5min，并记录5min内触电次数，满分为10分，被电击一次扣1分，所得分数为学习成绩。4h后重复测试。重复测试时，先将大鼠放于跳台上，同时秒表记录大鼠第一次跳下时间，为触电潜伏期，并记录3min内大鼠跳下的次数（错误数），满分为10分，跳下一次扣1分，所得分数为记忆成绩。
1.4 脑标本制备与判断
1.4.1 标本制备及Timm硫化银染色 ［3］ 阿拉伯胶、枸橼酸、枸橼酸钠、氢醌及硝酸银购自北京化学试剂公司。
1.4.2 结果判断 显微镜观察海马齿状回内分子层（inner molecular layer，IML），如见到棕褐色的色素带，提示海马内MF发芽。采用机显微图像分析系统（HPS-2000，华海公司）定量测定染色颗粒的光密度（D）。每一检测区各测3张脑片，求均值，作为该标本的平均D值。
1.5 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示。率的比较用χ 2 检验;组间比较采用方差分析。
2 结果
2.1 自发癫?发作现象 A组:实验期间P5、P15组均未见自发癫?发作，P25、P60组在KA注射10d左右［（10.5±2.4）d］自发癫?发作，发生率分别为20%（2只）和40%（4只），随着年龄增长自发癫?发作比率增高（χ 2 =8.628，P<0.05）。B组:P5、P15、P25组均未见自发癫?发作，P60组有1只（10%）自发癫?发作。B组自发癫?发作现象明显减少（χ 2 =3.914，P<0.05）。C、D组无自发癫?发作。
2.2 被动回避学习成绩见表1。
2.3 海马齿状回（IML）改变（图1，表2） 有自发癫?发作MF发芽程度（76.2±7.3）较无自发癫?发作（55.2±8）明显（P<0.001）。
表1 各组跳台成绩比较（略）
与D组比较，*:P<0.05，**:P<0.01（下表同）.
A.红藻氨酸致?;B.致?后注射苯巴比妥;C.未致?注射苯巴比妥;D.致?后注射生理盐水。1.P5;2.P15;3.P25;4.P60.
图1 大鼠海马苔藓纤维发芽现象（Timm染色 ×400）（略）
表2 各组海马齿状回MF染色颗粒光密度（略）
与A组比较，#:P<0.05，##:P<0.01.
3 讨论
3.1 海马内MF发芽是癫?发作基础 KA是脑内兴奋性氨基酸递质———谷氨酸的结构类似物。海马CA1、CA3区含有丰富的高亲和性的KA受体，使该区成为KA选择性损害的主要部位。在KA诱导的癫?过程中，KA首先损害齿状回门区的中间神经元，从而降低了颗粒细胞的抑制性，增加颗粒细胞对传入刺激的兴奋性，引起颗粒细胞过度兴奋，继而诱导突触的重组，而产生海马内MF发芽现象。由于MF为兴奋性氨基酸能神经纤维，因此MF发芽意味着海马内局部抑制性环路变成兴奋性环路，研究表明这种异常神经回路是癫?反复发作的重要原因 ［4-5］ 。实验可见，KA致?对P5、P15海马内MF发芽现象的影响较P25、P60轻，且自发癫?发作少。有自发癫?发作大鼠海马内MF发芽现象较无自发癫?发作大鼠明显。报道，大鼠发育早期谷氨酸能突触发育不好，KA受体的数量直到生后2～3周才达到成年水平，而且在幼年期受体对KA的亲和性低 ［5］。因此，KA致?所致的海马MF发芽、自发癫?发作与年龄的相关性可能与年幼鼠脑发育尚未完全成熟有关。此外，未成熟脑的可塑性、可代偿性较强，受损害后恢复较好，也可能是年幼致?鼠脑损害较轻的原因之一 ［6-7］ 。
3.2 海马内突触重组与认知功能关系 本实验还显示海马内MF发芽现象与癫?大鼠认知功能密切相关，MF发芽现象严重则学习记忆损害明显。中枢神经系统一个最显著的特征是在发育过程中形成有条不紊的神经细胞间相互连接即突触连接。这种精密的突触连接是脑内信息传递和处理的重要环节。海马是学习记忆的一个关键部位，海马齿状回IML内MF发芽现象的形成，提示海马突触连接上发生了某些形态和功能的变化。突触连接是神经系统信息传递的重要结构，正常的行为要求突触连接有高度的精确性，突触连接的异常可导致异常行为的发生 ［8-9］ 。因此，海马MF突触重组可能是癫?大鼠学习记忆功能障碍的重要原因。
3.3 PB影响认知功能的可能机制 癫?发作与抗癫?药物是影响癫?儿童认知功能的重要因素。PB是公认有效的传统抗癫?药，同时也被认为是对认知功能有影响的抗癫?药物之一 ［10-11］ 。从实验可见，PB可使不同发育时期大鼠自发癫?发作现象明显减少（P<0.05），证实PB抗癫?作用确切有效。关于PB对认知功能的影响程度和机制尚不明了 ［7］ 。本研究发现，PB对癫?动物与非癫?动物海马齿状回MF发芽现象和学习记忆功能的影响有很大区别。PB对未致?鼠海马齿状回IML内MF发芽现象无明显影响，在学习记忆测验中其对未致?鼠认知过程的影响仅见于P5、P15幼鼠的记忆过程，而对幼鼠的学习过程和年长鼠（P25、P60）的认知功能均无影响。由于本实验设计将被动回避性反射学习测验第一次跳台测验（学习过程）安排在每日注射药物之前，即处于药物的谷浓度;第二次跳台测验（记忆过程）安排在每日注射药物后2h，即处于药物的峰浓度。因此这一影响可能并非器质性病变所致，而系药物浓度相关的可逆性中枢抑制作用，提示PB在血药浓度较高的情况下对认知功能有不利的影响。这种影响与PB抑制中枢神经系统，干扰动物的觉醒程度，使动物对外界信息的注意力减弱甚至缺乏有关，从而影响了信息的接收、保存和巩固 ［10-11］ 。年长的动物受此影响可能较轻微，可能需要特异性、灵敏性较强的测验方法才能反映出来。由于儿童时期是接受、增长知识的关键时期。因此这一结果提示在儿童临床用药中，要注意合理地安排给药时间，使儿童在接受环境刺激和教育时，避开血药浓度的峰浓度，如采用睡前给药，将有助于减轻PB对认知功能的不利影响。
致?鼠海马齿状回MF发芽现象与学习记忆功能关系密切。在KA致?模型中，PB对P5、P15大鼠海马内MF发芽现象、大鼠学习功能无明显影响，这可能与年龄相关的脑发育未成熟和脑的可塑性、可代偿性较强有关 ［5-7］ 。对P25、P60致?鼠，PB可有效地控制自发癫?发作现象，但PB并不能减轻MF发芽现象和改善癫?大鼠学习记忆功能，反而使MF发芽现象更为明显并有加剧学习记忆功能损害趋势，由于这一损害发生于癫?发作控制之后，认知功能的损害不仅发生在记忆过程，而且也发生在学习过程，因此不能用反复癫?发作导致继发性认知功能损害或药物的中枢镇静作用解释，考虑为PB 导致的认知功能损害。海马MF突触重组导致神经细胞间信息传递障碍，可能是PB影响癫?大鼠认知功能的重要原因。关于PB加剧癫?大鼠海马MF发芽现象和癫?动物认知功能损害的原因尚不清楚。笔者以往研究提示选择性海马神经型一氧化氮合酶（nNOS）抑制剂7-硝基吲唑对这损害过程有逆转作用 ［12］ ，提示nNOS介导的NO通路可能参与PB对认知功能和海马MF发芽的影响。
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