促性腺激素对小鼠卵巢多功能蛋白聚糖表达的影响
【摘要】 目的 观察促性腺激素对野生型和bikunin基因敲除小鼠多功能蛋白聚糖（PG-M）表达的影响。 方法 应用免疫组织化学法检测激素处理后PG-M在野生型和bikunin基因敲除小鼠中的表达。 结果 PG-M阳性表达分布于排卵前卵丘颗粒细胞层，给予促性腺激素后，其表达增强。bikunin基因敲除小鼠的PG-M阳性表达较野生型弱，但在激素调节诱导排卵后，PG-M仍分布在卵丘细胞表面。 结论 PG-M是卵泡发育中一种基质成分。促性腺激素增强排卵中PG-M表达。
【关键词】 促性腺素类;卵巢;免疫组织化学;排卵;蛋白聚糖类;bikunin基因
多功能蛋白聚糖（versican，PG-M）是大分子蛋白聚糖，由糖胺聚糖连接到核心蛋白形成，分布在多种组织中。PG-M的N-端能和透明质酸（HA）结合，C-端还能和其他间质分子相结合。PG-M的许多功能是由蛋白聚糖中的硫酸软骨素链所决定。如PG-M能抑制大多数细胞和基质大分子的黏附主要是由于硫酸软骨素的作用 ［1］ 。在牛的卵泡基底膜和人的卵巢滤泡液均有PG-M的存在 ［2-3］ ，表明此类蛋白在卵巢滤泡中的结构性功能。笔者探讨促性腺激素对野生型和bikunin基因敲除小鼠卵巢内PG-M表达的影响，以期对PG-M在卵泡发育和排卵中的作用有进一步的认识。
1 材料和方法
1.1 试剂和动物 孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）购自Sigma公司。兔抗小鼠PG-M（CSα）抗体来自日本爱知医科大学分子医研究所。辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG和DAB显色试剂盒购于DAKO公司。野生型和bikunin基因敲除小鼠各8只，3～4周龄，体质量10～15g由日本爱知医科大学分子医科学研究所卓丽圣博士惠赠。
1.2 分组和给药方法 动物分为4组:PMSG野生型组，PMSG+HCG野生型组，PMSG基因敲除组，PMSG+HCG基因敲除组。给药方法:PMSG组（含野生型和基因敲除）腹腔内注射PMSG5IU，48h后处死，取卵巢4%多聚甲醛固定。PMSG+HCG组（含野生型和基因敲除）腹腔内注射PMSG48h后注射HCG5IU，12h后处死，取卵巢4%多聚甲醛固定。
1.3 免疫组织化学染色 卵巢标本固定后，经10%-20%-30%蔗糖梯度脱水，冷冻切片（Leica冷冻切片机，Cryocut1800Leica Co.，German）5μm厚度，PBS洗。免疫组织化学染色采用间接法。0.3%H 2 O 2 去除内源性过氧化物酶，4℃孵育30min，PBS洗。10%山羊血清封闭，4℃孵育30min。PBS洗。加兔抗小鼠PG-M（CSα）抗体（1∶100），4℃孵育过夜。对照组此步骤以兔血清（1∶1000）代替第一抗体作为阴性对照。PBS洗。加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，抗体浓度1∶1000，4℃孵育过夜。PBS洗。DAB显色。双蒸水中止反应。甲基绿染核。常规脱水，透明，封固。
2 结果
比较PMSG和PMSG+HCG野生型组，PMSG野生型组PG-M阳性表达（呈棕色）分布于未成熟卵泡的颗粒细胞层和膜细胞层（图1）;PMSG+HCG野生型组在促性腺激素刺激下，随着卵丘-卵母细胞复合体扩张，PG-M更多出现于卵丘细胞的表面和滤泡腔中，且颗粒细胞层内层阳性表达更强（图2）。
在bikunin基因敲除小鼠，PMSG基因组与DMSG野生型组比较，PG-M阳性表达（呈棕色）仅见于未成熟卵泡的颗粒细胞层，且表达更弱（图3）。给予激素后，PMSG+HCG基因敲除组PG-M分布于扩张卵丘及滤泡腔周围的颗粒细胞，与PMSG+HCG野生型组比较，滤泡腔中PG-M阳性表达未见减弱，颗粒细胞层外层和膜细胞层有PG-M阳性表达（图4）。
3 讨论
3.1 PG-M与排卵机制 在排卵机制研究方面，卵丘细胞外基质成分，如HA、透明质酸结合蛋白（HABP）对卵泡的发育、排卵影响愈来愈受关注。在卵泡的成熟过程中，卵丘细胞合成和分泌含大量HA的细胞外基质，HA通过与HABP结合表现出功能的多样性。多数的HABP有一个被称为link module的HA结合部位。卵丘细胞外基质中HABP的代表是PG-M。PG-M是卵丘细胞外基质主要成分之一，RT-PCR显示PG-M由颗粒细胞合成并分泌，在促性腺激素刺激下，12h达到并维持其高峰，但在膨大的卵丘-卵母细胞复合体中，其表达更为明显 ［4］ 。在卵巢排卵前这一时期，由于黄体生成素（LH）激发的排卵反应使卵泡发生一系列变化，如卵丘-卵母细胞复合体的扩张，从而有利于卵母细胞从卵巢排出。笔者发现，PG-M表达于原始卵泡和生长卵泡的颗粒细胞层，随着卵丘的扩张，更多的分布于卵丘-卵母细胞复合体的细胞外基质中。
3.2 促性腺激素对小鼠卵巢PG-M表达的影响 用针对PG-M的α抗原决定簇抗体检测到PG-M在卵丘-卵母细胞复合体中细胞外基质的存在，且阳性表达增强。在卵泡发育中，PG-M的表达渐增强，意味着PG-M可能在卵泡发育和排卵中的作用。在膜细胞层，观察到PG-M的阳性表达，其作用尚不清楚，估计可能参与成熟卵泡排卵后黄体的形成。PG-M在卵泡的发育成熟中可能和HA及扩张的卵丘细胞外基质的成分相互作用有关，并对细胞的迁移和黏附有重要影响。在体外培养诱发的膨大的卵丘-卵母细胞复合体细胞外基质中有PG-M的存在。在前期实验中，笔者观察到PG-M和HA共同分布于卵丘细胞外基质，说明在卵丘-卵母细胞复合体的扩张过程中，卵丘细胞生成PG-M和HA，参与卵丘细胞外基质的构建并稳定卵丘-卵母细胞复合体 ［5］ 。这种分布方式与血清来源的间α胰蛋白酶抑制剂（ITI）和蛋白聚糖TSG-6密切相关。这两种蛋白对细胞外基质的稳定有着重要作用，并影响随后的排卵和受精 ［6-8］ 。ITI含有三条肽链:重链HC1、HC2及轻链bikunin。敲除bikunin基因，血清来源的HABP不能和HA结合，使基因敲除小鼠的卵丘细胞外基质的形成受损。在观察到正常的野生型小鼠卵丘-卵母细胞复合体的细胞外基质中PG-M蛋白聚糖的阳性表达后，笔者进一步研究在bikunin基因敲除小鼠卵巢中PG-M蛋白聚糖的分布，发现该小鼠卵丘-卵母细胞复合体扩张受影响，PG-M蛋白分布在卵丘细胞及周围的细胞外基质。PG-M蛋白在野生型和bikunin基因敲除小鼠的扩张的卵丘-卵母细胞复合体分布相似，表明在bikunin基因敲除小鼠的扩张的卵丘-卵母细胞复合体，PG-M蛋白聚糖的结合部位是正常的。
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