大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定

                   作者：杨丽娟 ，翁绳美 ，林志雄  

【摘要】  目的 获取大鼠内皮抑素的cDNA片断，并构建融合蛋白的原核表达载体。 方法 以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT-PCR法从中扩增内皮抑素基因，并将获得基因重组入pThiohis表达载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值相符。 结论 成功构建大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-Endo。

【关键词】  内皮抑素;基因扩增;克隆，分子;大鼠

　　内皮抑素是O'Reilly等发现的一种内源性血管生成抑制因子 ［1］ 。随着对内皮抑素研究的深入，发现其在肿瘤临床诊断、和预后等方面具有广泛应用前景 ［2］ 。笔者根据大鼠内皮抑素基因序列，利用RT-PCR方法从大鼠脑组织中扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆，为进一步研究和应用奠定基础。
    
　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料 SD大鼠（福建医科大学实验动物中心）;Tag DNA polymernase、Top 10 感受态细胞及pThiohis vector、Trizol reagent购自美国Invitrogen life technologies公司;胰蛋白酶购自美国Sigma公司;One-step RT-PCR kit购自德国Roche公司;T 4 DNA ligase;kpnI、xbaI购自英国Biolabs公司;DNA Marker DL2000（大连TaKaRa公司）;PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒及小样质粒抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司），其余试剂均为国产分析纯。
   
　　1.2 PCR引物 据已知的大鼠内皮抑素基因序列（Gene Bank accession number，AF189709），利用机PCR引物设计软件Vector NTI6.0设计两对引物，endo1F和endo1R，endo2F和endo2R（含酶切位点，均由上海博亚生物工程公司合成）。
    
　　endo1F:5'TTACCCGGGAGTTCCACACC3'，endo1R:5'TGTGTCAAAGTTCTGCATCGC3';endo2F:5'GGGGTACC CATACTCACCAGGACTTTC3' （引入KpnI切点）， endo2R:5'GCTCTAGACTATTTGGAGAAAGAGGTC3' （引入xbaI切点）。鉴定引物为TrxF和 TrxR，TrxF:5'TTCCTC-GACGCTAACCTG3'，TrxR:5'TGTAAAACGACGGCCAGTGC3'。

　　1.3 方法

　　1.3.1 取1日龄SD大鼠1只，酒精消毒，迅速取出脑组织，取大脑半球0.5cm×0.5cm×0.5cm脑组织置-80℃中预冷30min后，置入匀浆器研磨粉碎（在碎冰中进行），总RNA的提取按照Trizol reagent总RNA提取法进行，其余脑组织置-80℃冰箱备用。通过甲醛变性电泳和D 260nm /D 280nm 光吸收检测抽取的总RNA的质量和浓度。
   
　　1.3.2 目的基因内皮抑素cDNA片段获得 目的基因分两步获得，首先利用RT-PCR方法，以抽取的大鼠脑组织中RNA为模板，以endo1F及endo1R为引物扩增含内皮抑素开放读码区的长约1kb的片段，反应体系总体积50μL，引物用量15pmol，反应条件:55℃30min→94℃2min→94℃0.5min→55℃0.5min→72℃1min→72℃7min→4℃∞，共30个循环。RT-PCR产物经琼脂糖电泳检测无误后，胶回收纯化（按说明书操作），溶于无菌水30μL备用。取回收的cDNA10ng为模板，以内皮抑素特异性引物endo2F和endo2R为引物，利用PCR方法，获得带有5'及3'端中分别含有kpnI和xbaI酶切位点的目的基因内皮抑素片断，PCR反应体系总体积50μL，引物用量15pmol，反应条件:94℃3min→94℃0.5min→55℃0.5min→72℃1min→72℃7min→4℃∞，共30个循环。PCR产物同样行电泳检测及回收纯化。
   
　　1.3.3 目的基因与载体的酶切、连接、转化及鉴定 经回收纯化的目的基因和载体分别行kpnI和xbaI双酶切，酶切反应体系总体积为20μL（37℃，水育，16h），酶切后产物经胶回收纯化。载体和目的基因经T 4 DNA ligase连接后转化至经CaCl 2 处理的TOP 10 感受态细胞，涂布于氨苄青霉素终浓度100μg/mL的等渗LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑克隆，在等渗含氨苄青霉素终浓度100μg/mL的LB溶液7～8mL扩增（37℃，300r/min摇床，10h），取扩增产物2mL按小样质粒抽提试剂盒说明书进行操作，抽提质粒，以所抽取的重组质粒为模板，以TrxF和TrxR为引物行PCR鉴定，PCR反应条件:94℃3min→94℃0.5min→55℃0.5min→72℃1min→72℃7min→4℃∞，共30个循环。所抽取的重组质粒同时也行kpnI和xbaI酶切鉴定，条件同上;扩增产物余3～4mL由上海博亚生物工程公司测序鉴定。
    
　　2 结果
    
　　2.1 目的基因内皮抑素 cDNA扩增一步法抽取得到的1日龄大鼠脑组织中RNA通过1%甲醛变性琼脂糖电泳分析，28s和18s两条rRNA条带完整，说明mRNA未发生降解，紫外分光光度计检测，D 260nm /D 280nm =1.82，D 260nm /D 280nm =2.0，浓度为0.8g/L，以上结果表明RNA的质量和浓度符合反转录的要求。

   
　　以上述总RNA为模板，以内皮抑素外侧区的引物endo1F和endo1R为引物，经过RT-PCR获得内皮抑素扩展的cDNA，再以此RT-PCR产物cDNA为模板，以endo2F和endo2R为引物行PCR，理论上扩增的内皮抑素基因片段应为682bp。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳后，在PCR Markers的第3、4条带之间，其大小与预期值相符（图1）。
 
　　M:DNA marker DL2000;1:带有kpnI和xbaI酶切位点的目的基因内皮抑素的cDNA片段.
    
　　图1  带有酶切位点的内皮抑素cDNA片断（略）
    
　　2.2 目的基因的克隆 上述基因片段和质粒pThiohis经kpnI和xbaI双酶切，经连接后转化Top 10 ，挑克隆，重组质粒pThiohis-Endo经上述双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶出现两条带，其中一条带>2000bp，另一条带位于700bp附近（图2）;以重组质粒为模板，以Trx F和TrxR为引物进行PCR扩增，其产物经1%琼脂糖凝胶，出现大小与内皮抑素cDNA片段相同迁移率的电泳条带（图3）。
 
　　M:DNA marker DL2000;1:空白对照;2.重组质粒pThiohis-En-do经kpnI和xbaI双酶切产物.
    
　　图2  重组子双酶切产物鉴定（略）

　　pThiohis-Endo以TrxF和TrxR为引物经PCR扩增产物.M:DNA marker DL2000;1.重组质粒
    
　　图3  重组子PCR鉴定（略）
    
　　2.3 重组子的序列测定 重组质粒pThiohis-Endo经测定序列，与已知序列相比完全一致。
    
　　3 讨论
    
　　3.1 许多研究发现，内皮抑素并不是由组织细胞直接分泌的，而是来源于机体胶原蛋白ⅩⅧ，经过蛋白酶水解产生的，其中与内皮抑素产生有关的蛋白酶主要有基质金属蛋白酶（MMP）、弹力蛋白酶和组织蛋白酶L等几种 ［3-5］ ，弹力蛋白酶可通过切割胶原蛋白ⅩⅧ的丙氨酸-组氨酸产生内皮抑素 ［3］ ，甚至内皮抑素也被组织蛋白酶所降解 ［4-5］ 。内皮抑素可诱导血管内皮细胞的凋亡，使内皮细胞G1期阻滞，并可抑制内皮细胞的迁移。但其确切的分子机制还不清楚。研究表明内皮抑素具有抑制肿瘤作用而不会引起抗药性，从而引起人们广泛的兴趣 ［1-2，6］ 。
   
　　3.2 目前，尽管人们不仅可从动脉管壁中抽取到内皮抑素 ［7］ ，也可从循环系统中分离出内皮抑素 ［8］ ，但是以此方法提取的内皮抑素有各种形式，其中有的具有生物学活性，有的则无活性 ［8-9］ 。同时，内皮抑素是一个极不稳定的蛋白，容易失活，故难以满足实验和临床应用的需要 ［10］ 。采用基因工程技术能大量产生重组内皮抑素，其纯度高，活性稳定和质量易于控制，是内皮抑素研究和应用的必然方向。本研究利用RT-PCR技术扩增了大鼠内皮抑素cDNA片段，通过定向克隆技术把目的基因重组入原核表达载体pThiohis，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值完全一致，说明成功地构建了大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-Endo，为进一步开发利用内皮抑素奠定了基础。
    

【】
  　［1］ O'Reilly MS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin:an endoge-nous inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］.Cell，1997，88（2）:277-285.

　　［2］ Mentlein R，Held-Feindt J.Angiogenesis factors in gliomas:a new key to tumor therapy［J］.Naturwissenschaften，2003，90（9）:385-394.

　　［3］ Wen W，Moses MA，Wiederschain D，et al.The generation of en-dostatin is mediated by elastase［J］.Cancer Res，1999，59（24）:6052-6056.

　　［4］ Felbor U，Dreier L，Bryant RAR，et al.Secreted cathepsin L gen- erates endostatin from collagenⅩⅧ［J］.EMBO J，2000，19（6）:1187-1194.

　　［5］ Ferreras M，Felbor U，Lenhard T，et al.Generation and degration of human Endostatin proteins by various proteinases［J］.FEBS Lett，2000，486（3）:247-251.

　　［6］ Boehm T，Folkman J，Browder T，et al.Antiangiogenic therapy of experimented cancer does not induce acquired drug resistance ［J］.Nature，1997，390（6658）:404-407.

　　［7］ Miosge N，Sasaki T，Timpl R，et al.Angiogenesis inhibitor endo-statin is a distinct component of elastic fibers in vessel walls［J］.FASEB J，1999，13（13）:1743-1750.

　　［8］ Standker L，Schrael M，Kanse SM，et al.Isolation and characteri-zation of the circulating form of human endostatin［J］.FEBS lett，1997，420（2-3）:129-133.

　　［9］ John H，Preissner KT，Forssmann WG，et al.Novel glycosylated forms of human plasma endostatin and circulating endostatin-relat-ed fragments of collagenⅩⅧ［J］.Biochemistry，1999，38（2）:10217-10233.

　　［10］ Cohen J，Behind the headlines of endostatin's，ups and downs［J］.Science，1999，283（5406）:1250-1251.