蛇床愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶的变化规律研究

【摘要】  目的：研究蛇床愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶活性的变化与过氧化物酶同工酶的差异。方法：采用分光光度法测定过氧化物酶活性，采用聚丙烯酰胺凝胶平板电泳分析过氧化物同工酶。结果：已分化愈伤组织的酶活性高于未分化愈伤组织，未分化愈伤组织、产生胚状体的愈伤组织及分化芽和根的愈伤组织的酶活性成线性递增关系。不同分化类型愈伤组织的过氧化物酶同工酶谱有明显的差异。三类愈伤组织都有酶带1和2，分化的愈伤组织都有3和5，分化芽和根的愈伤组织还有酶带4，分化芽和根的愈伤组织的酶带3比形成胚状体的愈伤组织的酶带3要宽，着色也深。结论：过氧化物酶活性与愈伤组织分化程度呈正相关；酶带1和2显示的两种同工酶与愈伤组织的增殖有关，酶带3和5是与分化有关的特异性蛋白质。酶带4可能催化器官发生特有反应，且对过氧化物酶的活性影响较大。

【关键词】  蛇床；愈伤组织；过氧化物酶；同工酶

   植物组织培养过程中形态发生的途径有两条，一是器官发生，一是胚胎发生。器官发生是由愈伤组织产生不定芽和不定根，进而形成植株；胚胎发生则是与合子胚相似的胚胎发生过程，由愈伤组织先形成胚状体，再由胚状体发育成完整植株。由于胚状体具有产生数量多、速度快、结构完整的特点，所以其理论和应用研究受到很大的重视。形态特征的变化是生理生化变化的外部反映，决定着分化和形态建成的方向［1］。建立胚状体发生的生化标识系统，通过改变外界因素诱导代谢向着有利于胚胎发生的方向进行，具有重要的意义。本实验以蛇床幼茎愈伤组织为测验材料，分析比较了未分化愈伤组织、分化不定芽愈伤组织与分化胚状体愈伤组织在过氧化物酶活性和过氧化物同工酶谱方面的差异，为分化机理的研究提供依据。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    供试材料为不同发育阶段的蛇床幼茎愈伤组织。未分化愈伤组织取自MS+2，4-D 1 mg/L +KT 0.4 mg/L培养基；分化不定芽愈伤组织（包括初生分化芽的愈伤组织和已分化芽及根的愈伤组织）取自MS+2，4-D 0.2 mg/L+ZT 0.4 mg/L培养基；分化胚状体愈伤组织取自MS+NAA 0.2 mg/L+ZT 0.4 mg/L培养基。

    1.2   实验方法

    1.2.1   过氧化物酶的活性测定［2］

    参照章骏德等编著的《植物生理实验法》，取分化程度不同的愈伤组织各1 g，冰浴研磨成匀浆，定溶至25 mL，1 000 rpm冰冻离心，取上清液1.0 mL，加pH 5.0的醋酸缓冲液1.0 mL，0.1%愈创木酚1.0 mL，0.08% H2O2溶液1.0 mL。在470 nm处测OD值，通过标准曲线酶活性。酶活性以每小时每克鲜重生成的4-邻甲基苯酚的量来表示。

    1.2.2   过氧化物同工酶的测定［3~6］

    聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr.）和胶联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis.）在催化剂的作用下，聚合而成的具有三维网状结构的凝胶。通过改变Acr.单体的浓度和交联度，可以控制凝胶孔径的大小。在不连续电泳过程中，通过样品的浓缩效应、凝胶分子筛效应以及一般分离的电荷效应，把酶、蛋白质混合物浓缩成区带、分离。

    本实验参照［3］的方法，采取Acr.单体浓度为7%的凝胶板（制胶配方见表1、表2），用酶活性测定中相同的材料及相同的方法制样，电泳，用联苯胺染色法染色。胶板照相记录，并制干板保存。

    2   结   果

    2.1   不同分化程度的愈伤组织过氧化物酶活性

    测定结果见表3。不同分化程度的愈伤组织过氧化物酶的活性测定实验结果表明，分化芽和产生胚状体的愈伤组织，酶活性高于未分化的愈伤组织，说明过氧化物酶活性与愈伤组织分化程度呈正相关。

    2.2   不同分化程度愈伤组织过氧化物同工酶的变化

    不同分化程度愈伤组织过氧化物同工酶谱成性变化，结果见图1。图1中a为未分化的愈伤组织的过氧化物同工酶谱，b为初生分化芽的愈伤组织的同工酶谱，c为已分化芽和根的愈伤组织同工酶谱，d为产生胚状体的愈伤组织的同工酶谱。

    3   讨   论

    一般认为，过氧化物酶的生理作用有三个：①具有吲哚乙酸氧化酶的作用；②具有木质化作用；③具有对创伤、照射的保护作用。无论是分化芽还是分化胚状体，都需要维管系统的建成，而过氧化物酶能使植物组织中所含C3-C6化合物转化成木质素，从而促进芽和胚状体的发育。由此可见，过氧化物酶活性是组织分化的一项重要指标［8］。芽分化时总是伴随着过氧化物酶活性的增加。丁宝莲等［7］在研究烟草叶肉细胞壁过氧化物酶时发现其活性从幼嫩叶片到成熟叶片，有一个从低到高、呈S形变化的曲线。徐竹筠［8］对胡萝卜体细胞胚胎发生的研究中发现，愈伤组织在分化或者形成胚状体的形成阶段，过氧化物酶活性都有增大趋势。与本实验研究结果相似。

    另外，实验还发现四种状态愈伤组织的过氧化物酶活性基本上呈线性递增关系。即初生分化芽、分化胚状体、分化芽和根的愈伤组织的过氧化物酶活性分别是未分化的愈伤组织过氧化物酶活性的2、3、4倍。这一结果可能与它们各自的维管系统的建成程度有关。

    在图1的同工酶谱中，四种材料电泳都存在酶带1和2，说明酶带1和2与愈伤组织的增殖有关，因为即使分化芽和胚状体的愈伤组织块中也包含一些未分化的愈伤组织薄壁细胞。发生分化的愈伤组织都有酶带3和酶带5，说明这两条酶带与愈伤组织的分化有关。已分化芽和根的愈伤组织的酶带3着色最深，酶带最宽，形成胚状体的愈伤组织的酶带3着色最浅。由于同工酶谱可以反映酶的相对活性，所以酶带3显示同工酶催化愈伤组织向器官发生的方向，且器官分化程度越高，相对酶活性越大。已分化出芽和根的愈伤组织还有酶带4，酶带4和酶带3位置接近，可能是一种与酶带3结构相似的同工酶。由于在产生胚状体愈伤组织的酶谱中不含此带，说明这是催化胚状体发育所没有的一种酶，在器官发生中起重要作用，可以作为区别器官分化和胚状体发生两种形态发生途径的生化指标。

    酶是基因的产物，是基因表达的结果。同工酶是一类分子结构不同而催化同一反应的酶。每一个同工酶的出现可能在代谢中都有它特殊的作用。同工酶谱的改变在一定程度上反映了与植物生长、增殖、分化和发育有关的特异性基因活动，因而在组织分化中通常作为分化的指标［9］。所以，药用植物培养愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶及其同工酶的变化对于分化机理的研究具有极其重要的意义。

【】
  ［1］王熊. 激素对植物培养细胞生化的调节作用［J］. 细胞生物学，1983（5）：40-45.

［2］章骏德. 植物生理实验法［M］. 南昌：江西人民出版社，1983：30-32.

［3］胡能书，万贤国. 同工酶技术及其应用［M］. 长沙：湖南技术出版社，1985：30-47.

［4］姜玲，万蜀渊，王绍柏，等. 乌天麻和红天麻及其杂种的同工酶分析［J］. 中药材，2001，24（8）：547-548.

［5］陈万生，乔传卓. 中药知母过氧化物同工酶谱分析［J］. 时珍国医国药，2000，11（6）：486-487.

［6］兰进，徐锦堂，王秋颖，等. 灵芝过氧化物同工酶和酯酶同工酶的研究［J］. 药学杂志，1998，33（12）：714-716.

［7］丁宝莲. 烟草叶肉细胞过氧化物同功酶研究［J］. 植物生报，1982（5）：127-132.

［8］徐竹筠. 2，4-D浓度对胡萝卜体细胞胚胎发生及其同工酶影响［J］. 植物生理学报，1984（11）：373-380.

［9］高文远，李志亮，肖培根. 甘草种子萌发初期过氧化物酶的研究 ［J］. 中国中药杂志，1998，23（4）：212-213.