对长期冷冻存储的蚯蚓溶栓酶活性分析

【关键词】  蚯蚓；冷冻存储；溶栓酶；酶活性

    蚯蚓作为活血化瘀药物在人类疾病康复中的应用，在我国已有悠久的。而生物化学、分子生物学及基因工程技术的应用，不仅从蚯蚓体内提取了具有纤溶作用的溶栓酶，而且有些蚯蚓溶栓酶的基因得到了克隆和表达［１，２］。作为传统中药的蚯蚓，需要在适当季节扑捉，及时剖开腹部，　除去内脏及泥砂，晒干或低温干燥；也可用草木灰呛死，去灰干燥后储存［３］，　但不适合保存蚯蚓体内的活性溶栓酶。我院于１９９２年开始双胸蚓溶栓酶的研究，为探讨长期保存含活性溶栓酶蚯蚓的条件，采用Ｆｏｌｉｎ－酚试剂法，对－１８　℃冷冻存储不同时间的蚯蚓原提取液的酶活性进行测定和对家兔实验性血凝块的溶解作用进行观测。结果显示，冷冻存储１２、３６、６０及１２０个月的蚯蚓体内残留生物活性分别为９９.４％、９８.８％、９７.４％及９９.１％；含蛋白（１　ｍｇ／ｍｌ）提取液完全溶解（３０±２）　ｍｇ血凝块的时间为６　ｈ，与冷冻存储初（７２　h）相比，酶活性和溶解血凝块时间变化不明显。发现在－１８℃冷冻存储的蚯蚓能较长期保存体内溶栓酶活性，不必考虑药源的季节性，为酶学研究及药物的生产提供方便。

    １  材料与方法

    １.１  材料来源  地龙：正蚓科（ｌｕｍｂｒｉｃｉｄａｅ），双胸蚓属（ｂｉｍａｓｔｏｓ）。在－１８℃冷冻存储７２ h、１２个月、３６个月、６０个月、１２０个月的自养蚯蚓。

    １.２  主要试剂  酪蛋白（上海化学试剂厂产品）；酪氨酸（上海康达氨基酸厂产品）　；Ｆｏｌｉｎ－酚试剂为本室配制并标定。

    １.３  方法

    １.３.１  酶活性测定  Ｆｏｌｉｎ－酚试剂法［４，５］，　以水解底物酪蛋白的程度表示，即用Ｆｏｌｉｎ－酚试剂法测定产物酪氨酸的含量，在３７℃，ｐＨ８.０条件下，每分钟水解１　μｇ酪氨酸为一个酶单位（ｕ）。

    １.３.２  蛋白含量测定  同Ｆｏｌｉｎ－酚试剂法［４］　。

    １.３.３  家兔血凝块的制备  取凝固２４ h的家兔血凝块，先用生理盐水洗去表面血细胞，再用滤纸吸去表面水分后切成(３０±２)ｍｇ小块备用。　

    ２  实验与结果

    ２.１  酶生物活性的测定  取冷冻存储的蚯蚓５０　ｇ解冻，然后分成１０份，分别剪碎并加入蚯蚓重量２倍体积的０.０１　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　８.０　Ｔｒｉｓ?ＨＣｌ缓冲液制成匀浆，于１３　０００转／ｍｉｎ，４℃离心２０ min，取上清为原提取液，按实验方法测定酶活性及蛋白含量，结果见表１。表１  双胸蚓原提取液酶活性及活性比较

　　２.２  对家兔实验性血凝块的溶解作用  将蚯蚓原提取液用生理盐水稀释含蛋白量至１　ｍｇ／ｍｌ（原提取液与生理盐水之比约为１∶２０）。取１０支小试管，各加入上述液体２　ｍｌ，分别放进制备好的血凝块，（对照管用０.０１　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　８.０　Ｔｒｉｓ?ＨＣｌ缓冲液和生理盐水与实验管等比例的液体）在３７℃水浴保温，观察完全溶解血凝块的时间。

    实验结果，冷冻存储不同时间的蚯蚓各实验管均在６　ｈ内完全溶解血凝块，与冷冻存储初（７２　ｈ）溶解时间（６　ｈ）一致，对照管>４８　ｈ不溶解。

    ３  讨论

    温度和时间是影响酶活性的二个重要因素，也是考察药物存储稳定性的重要参数。双胸蚓体内含有纤溶活性的蛋白水解酶［１，２］，而蚯蚓纤溶酶能水解酪蛋白［６］。采用Ｆｏｌｉｎ－酚试剂法测定双胸蚓溶栓酶活性与酶的含量成正比，且与溶解家兔的血凝块作用时间相平行。通过对酪蛋白水解作用和对家兔实验性血凝块溶解作用的观测，在－１８℃存储不同时间的双胸蚓，其比活性或残留生物活性变化不大，溶栓作用不变，说明长期冷冻存储的蚯蚓能较好地保存体内溶栓酶活性。一般低温不使酶破坏，温度回升后，酶又可恢复活性，但不可使蚯蚓反复冻溶。我们在连续三次冻溶蚯蚓溶栓酶的实验中发现，每冻溶一次，其生物活性降低８％左右，同时袋封保存也是必要的，避免了冷柜开门时空气对流对蚯蚓溶栓酶活性的影响。

【】
  ［１］程牛亮，牛勃，张祖，等．双胸蚓纤溶酶的纯化及性质［Ｊ］．生物化学杂志，１９９０，６（２）：１８６－１９０．

［２］陈飞，李莉，孟宪志，等．蚯蚓溶栓酶基因的克隆及非融合性表达［Ｊ］．药学杂志，２００３，３８（１２）：９６１．

［３］郑俊华．生药学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２００２．３３５．

［４］张龙翔，张庭芳，李令媛．生化实验方法和技术［Ｍ］．北京：人民出版社，１９８１.１６５．

［５］高英伟，伊德林．测定双胸蚓溶栓酶活性方法的探讨［Ｊ］．辽宁医学杂志，２００２，１６（３）：１４３．

［６］武金霞，赵晓瑜．酪蛋白平板法检测蚯蚓纤溶酶活性［Ｊ］．杂志，２００４，２６（３）：１８４