镉对小鼠睾丸精子生成的影响及其分子机制
【摘要】 目的:研究镉暴露对雄性小鼠精子生成的影响及其分子机制。方法:分别以1、5、10μmol/kg浓度氯化镉腹腔连续暴露小鼠，每天1次，连续5 d，测定睾丸指数和精子相对计数；同时应用单细胞凝胶电泳（single-cell gel electrophoresis，SCGE）技术检测睾丸生精细胞DNA损伤率和迁移长度。结果:三种剂量氯化镉处理组睾丸指数显著低于对照组（P<0.001），睾丸精子相对计数也显著低于对照组（P<0.05、P<0.001），生精细胞DNA损伤率和慧星细胞迁移长度显著高于对照组（P<0.001），且随剂量增加DNA损伤率和慧星细胞迁移长度也显著增加。结论:DNA链断裂可能是镉引起生精障碍的机制之一。
【关键词】 氯化镉 睾丸指数 DNA损伤 单细胞凝胶电泳
Abstract: Objective:To study the molecular mechanism of cadmium chloride on the damage of spermatogenic cell damage. Methods: Male mice were administered with cadmium chloride of 1、5、10μmol·kg-1·d-1 ip respectively for 5 day. To determine the testis index and sperm count, the proportion of DNA damage and length of DNA migrations of spermatogenic cell were determined with single cell gel electrophoresis(SCGE). Results: The testis index of three cadmium chloride group were lower than that of the control group（P<0.001）, The sperm count was lower than that of the control group, too（P<0.05、P<0.001）, The DNA damage rate and length of DNA migrations of spermatogenic cell were higher than that of normal group(P<0.001),and the damage was aggravated with the increasing of the concentration of cadmium chloride. Conclusion: The DNA strand break may be one of the possible mechanism of cadmium chloride on spermatogenic cell damage.
Key words: cadmium chloride; testis index; DNA damage; single cell gel electrophoresis
镉是一种有毒的重金属，是已知的最易在体内蓄积的环境毒物，对生殖系统有较敏感的毒性作用。随着的迅猛镉污染问题日益严重，大量的研究表明少量的镉进入人体即可通过生物放大作用和生物积累，对动物器官特别是睾丸及其细胞产生毒性作用，但镉对细胞毒性特别是对生殖细胞的毒性作用的机制尚不完全清楚。本研究观察了镉染毒处理后雄性小鼠睾丸指数和精子相对计数的变化，并用单细胞凝胶电泳技术检测镉对生精细胞的遗传损伤作用，以探讨镉对生殖细胞毒性的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 正常融点琼脂糖（Promega公司产品），低融点琼脂糖（Promega公司产品），二甲基亚砜（Sigma公司产品），十二烷基肌氨酸钠（华美生物工程公司产品），TritionX-100（FARCO公司产品），溴乙锭（Sigma公司产品），AR级氯化镉（医药上海化学试剂公司产品）。
1.2 动物 清洁级健康雄性ICR小鼠32只，体重（25±2）g，由温州医学院实验动物中心提供（医动字220030002号）。
1.3 动物分组与处理 取32只ICR雄性小鼠随机分为4组，每组8只，分别于腹腔注射氯化镉1、5、10μmol/kg，每天1次，连续5 d，对照组注射等体积生理盐水。于暴露第6天处死小鼠，取睾丸进行各项指标测定。
1.4 睾丸指数和精子相对计数测定 处死小鼠后称体重，取出双侧睾丸称重，睾丸指数[1]。睾丸精子相对计数测定Blazak等[2]方法进行，取左侧睾丸去除包膜，精确称重，移至组织匀浆管，加2 ml PBS，在匀浆器中匀浆，匀浆好后用血球计数板计数，重复4次，取平均值。睾丸精子相对计数用以下公式计算：总精子数/去膜后睾丸重量。
1.5 生精细胞DNA损伤率和彗星迁移长度测定 采用单细胞凝胶电泳法，取小鼠右侧睾丸，PBS制成细胞悬液，调细胞密度至0.3～0.6×1010个/L，测定细胞活力大于90%后参照[3，4]方法进行单细胞凝胶电泳，溴乙锭染色，荧光显微镜观察。每个样本计数50个细胞，每组共计数400个细胞，计算“调亡彗星”细胞的百分率。根据彗星尾部的DNA含量占细胞总DNA的比例，将DNA损伤程度分为5级[5]：0级：<5%，无损伤，细胞核完整；1级：5%～20%，中度损伤，可见彗尾，细胞核缩小；2级：20%～40%，中度损伤，可见明显彗尾，细胞核缩小；3级40%～95%，重度损伤，彗尾荧光信号强而密，并见明显缩小的细胞核；4级：>95%，完全损伤。每组测量50个细胞慧星尾长，计算慧星细胞迁移率。
1.6 统计学处理方法 均数（睾丸指数和精子相对计数、慧星迁移长度）的比较采用单因素方差分析法；损伤率的等级指标比较采用秩和检测，总损伤率比较采用卡方检验。
2 结果
2.1 氯化镉对小鼠睾丸指数和精子相对计数的影响 结果见表1。统计分析结果显示：1、5、10μmol/kg氯化镉组睾丸指数显著低于正常对照组(P<0.001)，并且随处理镉浓度的升高睾丸指数相应地减小，呈现显著的剂量效应关系，相关系数r=0.998(P<0.001)；各镉处理组的精子相对计数与对照组比差异也存在显著性（P<0.05），也随处理镉浓度的升高存在着一定的剂量效应关系，相关系数r=0.97(P<0.05)。
2.2 氯化镉对小鼠睾丸生精细胞DNA损伤率的影响 结果见表2。统计分析结果显示1、5、10μmol/kg氯化镉组细胞DNA损伤率显著高于对照组(P<0.01)，高浓度组DNA损伤率显著高于低浓度组(P<0.01)，氯化镉剂量的对数与睾丸生精细胞总损伤率呈现显著的剂量效应关系，直线相关系数r=0.997(P<0.001)。
2.3 氯化镉对小鼠睾丸生精细胞慧星迁移长度的影响 结果见表3。统计分析显示1、5、10μmol/kg氯化镉处理组生精细胞慧星迁移长度显著高于对照组（P<0.05，P<0.001），且随剂量增高其慧星迁移长度也相应增加，呈现显著的剂量效应关系，直线相关系数r=0.96(P<0.05)。
3 讨论
近几年对镉金属的大量研究证实，镉对小鼠具有明显的生殖毒性，在形态学上和功能上都有明显影响[7]，并有研究显示镉可以诱导雄性动物睾丸、附睾等组织器官发生结构功能上的退行性变化[8]，最后导致雄性动物生殖能力的减退。但在镉引起小鼠生殖毒性分子机制方面的研究报道甚少。我们结合研究现状，应用单细胞凝胶电泳技术研究氯化镉对小鼠睾丸生精细胞DNA损伤，并检测小鼠睾丸指数和精子相对计数相应的变化，进一步阐述重金属镉引起小鼠生殖毒性的分子机制。
本研究以低、中、高三种浓度的氯化镉通过腹腔注射，急性染毒正常成年小鼠，最后检测小鼠睾丸指数、相对精子计数以及小鼠睾丸生精细胞DNA损伤和对损伤形成的彗星尾巴迁移长度等指标。通过研究表明：急性染毒氯化镉可致使小鼠睾丸指数和精子相对计数等小鼠生殖指标明显变化，且随着镉剂量的增加变化更加明显。同周龄重量相仿的小鼠，随镉剂量增加，睾丸体积逐渐变小，重量逐渐减轻，高浓度组的小鼠睾丸质地明显变硬；同时随镉剂量增加，精子数量也明显减少，这明确显示重金属镉对小鼠的生殖器官和生殖细胞等具有明显的损伤作用，并与镉的浓度呈正相关。我们用单细胞凝胶电泳技术检测了正常小鼠和镉处理小鼠睾丸生精细胞DNA的损伤情况，同样成熟小鼠，正常的小鼠生精细胞DNA损伤率在10%左右；经氯化镉处理后，生精细胞DNA损伤率明显升高，且处理镉浓度越高，DNA损伤率也越明显，呈一定的线性关系，这说明处理镉的浓度越高，损伤的生精细胞DNA就越多；我们同时测量了彗星尾巴迁移长度，也显示镉处理组的彗星尾巴迁移长度明显长于正常对照组，且随着镉浓度的增加，损伤DNA的慧星迁移长度也明显地增加，同样也呈一定的线性关系，可以说明随着镉浓度的增加，生精细胞DNA损伤的程度明显增加，其断裂的DNA碎片也越多，断片的分子量越小。因此我们的研究表明镉对生殖细胞造成损伤的机制与生殖细胞DNA损伤有密切的关系，镉的浓度越高生精细胞DNA损伤的数量就越多，断裂的碎片就越多，损伤的程度就越深，对生殖造成的伤害也就越明显。
【】
[1] 金龙金,张军明,董杰影.醋酸铅对雄性小鼠生殖功能的毒性作用[J].生殖医学杂志,2003,12(5):288-291.
[2] Blazak WF,Treinen KA,Juniewicz PE.Application of tes-ticular sperm head counts in the assessment of male repro- ductive toxicity[J].Methods Toxicol,1993,3A:86-94.
[3] Singh NP, McCoy MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells [J]. Exp Cell Res, 1988, 175(1): 184-191.
[4] 董杰影,金龙金,楼哲丰.氯化汞对离体小鼠骨髓细胞和睾丸生殖细胞DNA的损伤作用[J].温州医学院学报,2004,34(3): 207-209.
[5] 余日安,陈学敏. 镉对大鼠肝细胞DNA损伤作用的研究[J]. 公共卫生学报,1998, 17(2):106-107.
[6] 刘伟成,李明云.镉毒性毒研究[J].广东微量元素,2005,12(12):1-5.
[7] Holt WV. Palomo MJ.Optimization of a continuous real- time computerized semen analysis systerm for ram sperm motility assessment,and evaluation of four methods of se-men preparation[J]. Reprod Fertil Dev ,1996,8(2):219-230.
