化痰活血软坚法干预肾小球硬化机理的实验研究

【摘要】  目的：探讨化痰活血软坚法防治肾小球硬化的作用机理。方法：将Wistar大鼠随机分为正常组，模型组和中药组。除正常组外，其余大鼠制成肾小球硬化大鼠模型。中药组大鼠灌胃中药（1 mL/100 g），其余两组灌胃等量蒸馏水，共12 w。然后观察各组大鼠肾组织TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9mRNA的表达。结果：与模型组比较，中药组大鼠肾组织TGF-β1和TGF-β1mRNA表达显著降低（P＜0.01），MMP-9mRNA表达显著升高（P＜0.01）。结论：减少肾组织TGF-β1的产生和分泌、促进MMP-9mRNA表达是化痰活血软坚法发挥效应的重要机理，而抑制TGF-β1mRNA的表达是减少TGF-β1产生和分泌的原因之一。

【关键词】  化痰活血软坚法 肾小球硬化 TGF-β1 MMP-9mRNA

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验动物    Wistar大鼠，雄性，体重（180～200）ｇ，山东大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁）20030004。

    1.1.2   药品与试剂  化痰活血软坚汤由海藻、丹参、大黄、黄芪、当归组成。上药水煎2次，大黄后入，滤取药液合并，减压浓缩（80 ℃）为0.4 g/mL，低温保存备用。使用前放至室温并摇匀。亲和纯化兔抗人多克隆TGF-β1抗体：Santa Cruz Biotechnology，Inc.产品；FITC-羊抗兔IgG、TGF-β1mRNA原位杂交试剂盒、MMP-9 mRNA原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。盐酸多柔比星，深圳万乐药业有限公司生产，批号：0103Ｅ1，使用时以生理盐水稀释成1 ｍｇ/ｍL的溶液。

    1.2   实验方法

    1.2.1   动物分组   将40只Wistar大鼠随机分为正常组10只、模型组15只、中药组15只，自由饮水进食，1 w后进行实验。

    1.2.2   模型制备   30只大鼠称重，腹腔注射（0.2 mL/100 g体重）1.75%戊巴比妥钠生理盐水溶液麻醉，从背部摘除左肾，缝合伤口。正常组行假手术，不摘除肾脏，余与上同。手术1 w后，30只造模大鼠尾静脉注射阿霉素5 mg/kg，手术5 w后注射阿霉素3 mg/kg。正常组尾静脉注射生理盐水。

    1.2.3   给药方法   第1次注射阿霉素1 w后，中药组灌服中药（1 mL/100 g体重），正常组和模型组给予等量蒸馏水。连续给药12 w。

    1.2.4   标本采集   摘取右肾，迅速冠状切开，分别以10%甲醛和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蜡包埋。甲醛固定组织切片厚度4 μm，多聚甲醛固定组织切片厚度6 μm。

    1.2.5   指标观察

    1.2.5.1   肾组织TGF-β1检测   采用免疫荧光细胞化学技术。兔抗人TGF-β1抗体1∶100稀释，PBS代替一抗作为阴性对照。激光共聚焦显微镜观察，并用Laser Micrscope LSM510 Version 2.5 SP2软件处理，每张切片任选5个视野，其平均荧光强度，作为该样本TGF-β1的相对表达量。

    1.2.5.2   肾组织TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA检测   采用原位杂交法。OLYMPUS BX41光学显微镜观察，每张切片任选10个肾小球，OLYMPUS C-4000ZOOM数码相机照相（光亮度设定一致），用Image-proplus 4.5图像分析软件对结果进行半定量分析，每张切片随机选取10个视野，测定10个视野的积分光密度，以均值作为该样本MMP-9mRNA的相对表达量。

    1.2.6   统计学方法   数据以均数±标准差（x±s）表示，数据统计以SPSS11.0统计分析软件进行单因素方差分析。

    2   结   果

    2.1   各组大鼠肾组织TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9 mRNA的表达

    结果见表1。

    由表1可知，模型组大鼠肾组织TGF-β1mRNA、TGF-β1表达显著高于正常组（P＜0.01），中药组大鼠二者的表达显著低于模型组（P＜0.01）。模型组大鼠肾组织MMP-9mRNA表达比正常组显著降低（P＜0.01），而中药组大鼠肾组织MMP-9mRNA表达则比模型组显著升高（P＜0.01）。

    3   讨   论

    TGF-β1是肾小球疾病进展的重要介导因子，在免疫介导及非免疫介导的肾脏损伤模型中，系膜细胞、内皮细胞及浸润巨噬细胞均可合成TGF-β1。在慢性肾衰复杂的病理机制中，如肾小球的高灌注、高滤过，肾小管损伤和间质纤维化，蛋白尿促进肾小球间质纤维化等多个环节均有TGF-β1参与。TGF-β1促进系膜细胞产生部分ECM并抑制其降解，增加细胞对ECM的黏附，促进ECM在肾小球内积聚，并有调节多种细胞因子的作用，从而直接参与肾小球硬化过程。肾脏病理组织学研究表明，在已有病变的肾小球中TGF-β1主要通过至少3种途径促进ECM的积聚：①促进ECM成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原和多种蛋白多糖的合成；②抑制ECM的降解，既抑制降解ECM成分的酶类如胶原酶系的合成，又促进纤溶酶原激活物抑制因子和金属蛋白酶组织抑制因子等的表达；③促进整合素的表达，进一步促进ECM表达 ［1］。

    MMP-9属于基质金属蛋白酶家族成员之一，又称为Ⅳ型胶原酶，对ECM的合成和分解起着重要的作用，其功能是参与ECM （主要为Ⅳ型胶原）的降解。既往研究证实肾小球固有细胞可合成和分泌MMP-9，与MMP-2共同参与保持肾组织ECM的动态平衡 ［2］。MMP-9分泌减少或其抑制物TIMP-1分泌增加，均可成为ECM积聚的重要原因。

    本研究结果表明，化痰活血软坚中药能显著减弱模型大鼠肾组织TGF-β1mRNA、TGF-β1的高表达，提示化痰活血软坚法抗肾小球硬化的效应与其抑制TGF-β1mRNA表达及TGF-β1的分泌，从而减少ECM的积聚有关。化痰活血软坚中药还具有促进MMP-9mRNA表达的作用，表明化痰活血软坚法可能通过促进MMP-9mRNA表达而增加MMP-9的产生和分泌，参与ECM的降解，因而发挥防治肾小球硬化的作用。

【】
  ［1］孙娜，刘必成. 尿TGF-β1检测在肾脏疾病诊断中的临床意义［J］. 国外医学·泌尿分册，2002，22（1）：3-6.

［2］Vu T H，Shipley J M，Bergers G，et al. MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes［J］. Cell，1998，93（3）：411-422.