新鲜与保存人羊膜超微结构初步观察
作者：马卫东，管卫群，王咏梅，3张天一，林琳，张晓娟，宋愈，吴莹
【摘要】 目的：对新鲜和保存人羊膜的超微结构进行观察，从形态学角度探讨人羊膜超微结构与其眼表重建之间的关系。方法：采用扫描电镜、透射电镜和光镜分别对新鲜和低温（-80℃）纯甘油中保存6个月人羊膜的超微结构进行观察。结果：电镜下保存羊膜上皮细胞结构保持完整，分泌颗粒与细胞间连接、微绒毛和微皱褶结构均存在。光镜下保存羊膜仍维持完整立方上皮层，细胞形态整齐，两者基底膜完整。结论：新鲜和保存人羊膜均具有完整的上皮细胞层和基底膜，从形态学角度推测羊膜重建眼表的作用与此有关。
【关键词】 羊膜；超微结构；眼表重建
[Abstract] Objective：To observe the ultrastructure of fresh and preserved human amniotic membrane and research for the relationship between the ultrastructure of human amniotic membrane and ocular surface reconstruction from morphologic view point. Methods：Transmission electron microscope, scanning electron microscope and optical microscope were used to observe the ultrastructure of fresh and cryopreserved（-80℃）human amniotic membranes for 6 months in pure glycerin. Results：Preserved human amniotic membrane had the same stucture of regular and intact epithelial cells as the fresh one. Their conformation, arrangement, microvilli microplicae, cell junctions and secreted grains still existed even though they had been cryopreserved for 6 months. Conclusion：The human amniotic membrane cryopreserved at -80℃ for 6 months in pure glycerin has the same ultrastructure as the fresh one.
[Key words] Amnion； Ultrastructure； Ocular surface reconstruction自1995年Kim和Tseng首次报道保存人羊膜移植重建实验性兔眼眼表结构获得成功以来[1]，人羊膜移植已被大量应用于眼表疾病的临床中，效果明显[2~4]。本研究采用电镜和光镜分别对新鲜和保存人羊膜的超微结构进行观察，从形态学角度探讨人羊膜超微结构与眼表重建之间的关系。
1 材料和方法
1.1 羊膜的取材、保存和解冻 随机选择5例在我院产科接受剖宫产分娩的健康产妇，筛选条件为足月、产前母体血清学排除了HIV和HBV、HCV及梅毒。无菌条件下分别从剖腹产娩出的胎盘上取一块胎膜组织，光滑面（羊膜上皮面）朝上，平铺于无菌布巾上，用无齿镊钝性剥离并弃去绒毛膜，将羊膜片剪成1 mm×2 mm大小数块，一半放入4%戊二醛溶液中固定并立即送电镜和光镜观察。另一半置入无水甘油中脱水后，将其移入盛有无水甘油的灭菌小药瓶中密封并置-80℃低温冰箱中冷冻保存6个月。解冻时从-80℃低温冰箱中取出，常温下解冻后，在林格氏液中复水2次，每次约10分钟，然后放入4%戊二醛溶液中送检。
1.2 主要试剂 进口分装戊二醛；英国JMC公司产锇酸；乙醇和丙酮购自北京化学试剂公司；进口环氧树酯812；上海新中化工厂产枸橼酸铅；进口醋酸异戊酯。以上试剂均为分析纯级。
1.3 主要仪器 瑞典LKB-Ⅴ超薄切片机；日本公司JEM-100S型透射电镜和JSM-T300型扫描电镜，日本Olympus BX50光学显微镜。
1.4 实验方法 采用透射电镜、扫描电镜和光镜分别观察新鲜人羊膜，6个月后同样方法再观察保存人羊膜。（1）透射电镜观察：在4%戊二醛溶液中固定羊膜，采用磷酸盐缓冲液（pH值为7.2~7.4）冲洗，1%锇酸后固定，乙醇梯度脱水，100%丙酮浸透，环氧树酯包埋、制片。将铺于铜网上的切片经枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色后，用透射电镜观察并照相；（2）扫描电镜观察：继上100%丙酮浸透后，改用100%醋酸异戊酯置换，临界点干燥仪干燥，离子溅射仪真空喷金，用扫描电镜观察并照相；（3）光镜观察：4%甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，苏木素—伊红（HE）染色，光学显微镜观察。
2 结 果
2.1 透射电镜观察 羊膜组织可分为5层，由内向外依次为上皮细胞层（单层无纤毛立方上皮）、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。新鲜人羊膜上皮细胞具有完整的细胞膜、丰富的细胞器和分泌颗粒、相邻上皮细胞间以桥粒和紧密连接相连接，细胞表面有大量的微绒毛和微皱褶结构（图1）。冷冻保存6个月后羊膜上皮细胞的细胞膜、细胞核完整，细胞器与分泌颗粒及细胞间连接均与新鲜羊膜上皮细胞基本相似，仅顶面微绒毛和微皱褶结构较保存前稍短（图2）。
2.2 扫描电镜观察 新鲜人羊膜上皮细胞排列极其规则，其表面具有丰富的微绒毛，细胞间除有连接外，还有较多的微孔隙，保存6个月后羊膜上皮细胞形态仍极规则，其表面的微绒毛变得粗短、疏松，细胞间微孔隙加大，但相邻细胞间连接仍存在（图3,4）。羊膜致密层和海绵层胶原纤维形成分子筛立体构型（图5,6）。
2.3 光镜观察 保存羊膜与新鲜羊膜均具有完整的立方上皮结构，上皮细胞完整且形态规则，两者基底膜完整（图7,8）。观察5例，结果基本一致。
3 讨 论
维持眼表上皮的稳定是眼表重建成功的标志。本实验结果显示，新鲜人羊膜和低温（-80℃）保存6个月的人羊膜均具有完整的上皮层，因而移植后可立即重建眼表上皮，防止胶原组织暴露，有效阻止胶原的溶解。临床实践证明，新鲜和保存人羊膜均可有效重建眼表上皮，且术后3个月左右羊膜上皮逐渐被受体眼结角膜上皮所替代[3,4]。
羊膜的保存时间，至今尚无定论。Dua等认为，在-80℃低温条件下保存的羊膜其上皮细胞已被灭活[2]。本实验通过透射电镜和扫描电镜观察发现，低温（-80℃）条件下纯甘油保存6个月的羊膜其上皮细胞的细胞膜、细胞核完整，细胞器与分泌颗粒以及细胞间桥粒连接均与新鲜羊膜上皮细胞基本相似，其表面的微绒毛和微皱褶结构仍在, 并且不具有Kerr（1972）描述的细胞缩小变圆、失去原有形状、微绒毛及细胞间连接消失、凋亡小体等细胞凋亡的超微结构特征。从这种意义上说，在-80℃低温条件下纯甘油中，人羊膜至少可保存6个月以上。
角膜上皮细胞可分3层，由内向外依次为基底细胞、翼状细胞、表面细胞。表面细胞分两层，紧接泪膜的表面具有许多微绒毛和微皱褶, 对角膜前泪膜的滞留起着重要作用[5]。本实验结果显示，人羊膜上皮细胞排列紧密、规则，且羊膜上皮细胞表面的微绒毛和微皱褶，对泪膜的滞留可能起着同样的作用。
电镜下羊膜分5层，且无血管、神经及淋巴，这与以往的描述一致。羊膜本身就是一层生物透析膜，早期的羊水就是母体血清经羊膜透析而成[6]。本实验还观察到，羊膜的上皮细胞层具有许多微孔隙，致密层和海绵层胶原纤维形成具有许多微孔隙的分子筛立体构型。推测，小于孔隙的药物分子将能通过羊膜到达羊膜下并蓄积，由此可提高药物的局域浓度，延长药物的作用时间。同样，角膜基质内过多的水分子也将由此排出，从而改善角膜大泡的症状，此可为羊膜移植大泡性角膜病变提供理论支持。这一过程究竟是主动转运，还是单纯扩散，还需要更进一步的实验来证实。
【】
[1] Kazuomi H, Jun S, Shigeto S, et al. Multilayered amniotic membrane transplantation for severe ulceration of the cornea and sclera[J]. Am J Ophthalmol, 2001, 131(3):324-331.
[2] Dua HS, Azuara-Blanco A. Autograft limbal transplantation in patients with unilatenal corheal stem cell deficiency[J]. Br J Ophthalmol,2000,84(2):272-277.
[3] 陈家祺,周世有,黄 挺,等. 新鲜羊膜移植治疗严重的急性炎症期及瘢痕期眼表疾病的临床研究[J]. 中华眼科杂志,2000,36(1):13-17.
[4] 马卫东,管卫群,王咏梅,等.单层或多层羊膜移植治疗眼表疾病[J].眼科,2002,11(5): 278-280.
[5] 管怀进. 眼[M]. 第1版. 北京：科学出版社，2006：9-10.
[6] 乐 杰.妇产科学[M].第6版. 北京:人民卫生出版社,2004：36-34.
