灯盏花素注射液中非法添加物的研究初探

                作者：葛建华，刘丽芳，郑红利 朱磊，谢丽丽 

【摘要】  目的：分析中成药灯盏花素注射液中的非法添加物。方法：通过理化鉴别、薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等方法初步对添加物进行定性，采用HPLC方法对添加物的含量进行测定。结果：非法添加物呈维生素C鉴别的阳性反应；且维生素C进样量与峰面积在0.1004～1.0040 μg范围内，呈良好的线性关系，回归方程Y=3006.7x-9.5449，r=0.9998（n=6）；平均回收率为102.05%（n=6）。结论：灯盏花素注射液中非法添加维生素C,并测得其含量为8.0858 mg/ml。

【关键词】  灯盏花素注射液；高效液相色谱法；薄层色谱法；紫外分光光度法；维生素C

    [Abstract]   Objective: To analyse the illegal additive in TCM breviscapine injection. Method: Methods of chemical reactions ,TLC,UV-Spectrophotometry and HPLC, were adopted for the qualitative analysis. Results: Chemical reactions which were applied to test Vc were positive .There was a good relationship when the content of VitC  was 0.1004～1.004 μ(r=0.9998).The average recovery was 102.05%. Conclusion: The experimental results indicated that: VitC was added to the injection illegally ,and the content of VC was 8.0858mg/ml.

    [Keywords]   TCM breviscapine injection；High performance liquid chromatography；Ultraviolet spectrophotometry；Thin-layer chromatography；Vitamine C

    灯盏花素注射液被收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第20册，具有活血化瘀，通络止痛之功效[1]。灯盏花素是从菊科植物短葶飞蓬中提取的黄酮类成分，是以灯盏花乙素为主，含少量灯盏花甲素的混合物[2]，主要用于心血管疾病，改善血液循环。笔者对黑龙江某厂生产的一批灯盏花素注射液进行光谱扫描时，发现本该在284 nm[1]波长处出现的最大吸收漂移至270 nm处，经多方面分析研究,怀疑擅自添加维生素C类物质。中成药的毒副作用较小，在中药中擅自添加西药成分对患者危害较大。本文通过多种分析方法，对该批注射液中的添加物进行了初步的鉴别测定。

    1   仪器与试药

    ZF-2型三用紫外分析仪；SARTORIUS BP 211D分析天平；瓦里安Cary 100紫外可见分光光度计；Agilent1100系列高效液相色谱仪（四元梯度泵、二极管阵列检测器）； METTLER 320pH酸度计。对照品：维生素C（药品生物制品检定所，批号：100425-200301）；供试品：灯盏花素注射液（黑龙江某制药厂生产，批号：060204）；阴性对照品：灯盏花素注射液（山西省万荣三九药业有限公司生产，批号：0606271）；薄层硅胶预制板：HF254， 200 mm×200 mm（青岛海洋化工厂生产）；HPLC用甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

    2   方法与结果

    2．1   定性研究

    2．1．1   理化鉴别[3]   （1）取供试品5 ml，加硝酸银试液0.5 ml，即生成银的黑色沉淀；（2）取供试品5 ml，加二氯靛酚钠试液1~2滴，试液的颜色即消失。可见，供试品呈现维生素C鉴别的阳性反应。

    2．1．2   薄层色谱法鉴别   （1）溶液的制备：精确称取维生素C对照品13.98 mg，置5 ml容量瓶中，加入乙醇适量使其溶解，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品、阴性对照品各1 ml分别置10 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别作为供试品、阴性对照品溶液；（2）试验方法及其结果：取对照品溶液、供试品溶液各2 μl，阴性对照品溶液4 μl，分别点于同一硅胶HF254薄层板上，以氯仿-乙醇-冰醋酸-水（54∶42∶10∶9）为展开剂，暗处饱和15分钟，展开，取出，晾干后在紫外光灯（254 nm）下检视。结果供试品溶液在与维生素C对照品溶液相应的位置上显相同颜色的荧光斑点（比移值Rf供试品= RfVc对照品=0.53），而阴性对照品溶液在相应的位置处没有显示荧光斑点。

    2．1．3   紫外分光光度法鉴别   （1）溶液的制备：精确量取上述对照品溶液0.2 ml置50 ml容量瓶中，加0.01 mol/L HCl溶液稀释至刻度,摇匀, 作为对照品溶液。精密量取供试品溶液、阴性对照品溶液各1 ml分别置10 ml容量瓶中，加0.01 mol/L HCl溶液稀释至刻度，过滤，分别吸取续滤液1 ml置100 ml容量瓶中，加0.01 mol/L HCl溶液稀释至刻度,摇匀,分别作为供试品、阴性对照品溶液；（2）方法及结果：取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，分别于200～300 nm波长进行光谱扫描测定。结果对照品溶液、供试品溶液在242 nm波长处均有唯一最大吸收峰（此为维生素类在酸性条件下的特征吸收峰），而阴性对照品溶液在该波长处无吸收峰（见图1）。

    2．1．4   高效液相色谱法鉴别   （1）色谱条件：色谱柱：C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH值至3.0）（5∶95）；检测波长243 nm；流动相流速0.9 ml/min；柱温30℃；进样量10 μl；（2）溶液的制备：精密称取维生素C对照品10.04 mg，置100 ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)过滤,取续滤液, 作为对照品溶液。精密量取供试品溶液、阴性对照品溶液各1 ml，分别置100 ml的容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀后精密量取5 ml，置10 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，分别作为供试品、阴性对照品溶液；（3）试验方法及其结果：分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液注入高效液相色谱仪测定。结果对照品溶液、供试品溶液在相同的保留时间处有色谱峰，而阴性对照品溶液在此保留时间处无色谱峰，且对照品溶液和供试品溶液在此保留时间处的光谱图一致（见图2，3，4）。

    2．2   定量研究

    2．2．1   色谱条件，溶液的制备及试验方法同2.1.4。

    2．2．2   标准曲线的制备   用移液管分别精密移取对照品溶液2.5，5，10，15，20，25 ml置25 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤,取续滤液,进样。以峰面积Y与对照品进样量X进行线性回归，结果表明对照品在0.1004～1.004 μg范围内，线性关系良好，其回归方程：Y=3006.7x-9.5449，r=0.9998。

    2．2．3   方法学考察及含量测定   （1）精密度实验：精密量取“2.1.4（2）”项下的对照品溶液10 ml置25 ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD为0.86%；（2）重复性实验及含量测定：照“2．1．4（2）”项下供试品溶液的制备方法，配制6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算得本品含量为8.0856 mg/ml, RSD为1.86%；（3）稳定性实验：精密量取“2.1.4（2）”项下的对照品溶液10 ml置25 ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，滤过。每隔30分钟进样一次,测定峰面积，计算其RSD为0.83%。可见，对照品溶液在3.5 h内稳定；（4）加样回收试验：对照品溶液的制备：精密称取维生素C对照品51.41 mg，置100 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取已知含量的供试品溶液6份，每份0.5 ml。1，2两份精密加入上述对照品溶液 6 ml；3，4两份8 ml；5，6两份10 ml，分别用流动相稀释，测定。回收率=（测得含量-样品含量）/加入量×100%；（5）空白试验。取“2．1．4（2）”项下的阴性对照品溶液，进样分析，可见灯盏花素注射液中其他成分对该波长处的测定无干扰（见图4）。

    3   讨      论

    本文通过不同鉴别方法进行相互验证，初步认为该批灯盏花素注射液中的非法添加物为维生素C类。要确定其结构，还需应用MS、NR等分析方法，作进一步研究。维生素C是无毒的营养素， 本案例中的维生素C很可能是作为抗氧剂加入的，但已影响到该制剂的质量检验结果，故视为非法添加。

    以甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH至3.0)（5∶95）为溶剂进行紫外扫描，对照品与供试品在同一波长（243 nm）处有最大吸收，且没有其它干扰，因此选择该溶液作为本文中HPLC的流动相。

    目前，测定维生素C含量的方法一般采用电位滴定法[4]、碘量法[3]等，但所有这些方法都有标准溶液标定繁琐、操作程序复杂、费时等缺点。本文采用的含量测定方法操作简便，重现性好，精密度高，适合于维生素C的含量测定，更适合于灯盏花素注射液的质量监测与控制。

    笔者曾参照[5]报道的UV法测定该批灯盏花素注射液中所添加维生素C的含量，其结果为8.0625 mg/ml,与本文实验数据相一致。

【文献】
  [1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂第二十册）[M].1998∶102.

[2] 代 勇，刘三康，付春梅等. 灯盏花素注射液的含量测定及有关物质的检查[J].华西药学杂志. 2005，20(2)：147.

[3] 国家药典委员会.药典（二部）[M].北京：化学出版社,2005：669.

[4] 陈秋丽，甘振威，张娅捷等．电位滴定法测定蔬菜和水果中的维生索C[J]．吉林大学学报(医学版)，2004，30(5)：821．

[5] 袁叶飞，甑汉深，欧贤红. 分光光度法测定大枣中的维生素C含量[J].安徽中医学院学报. 2006.4，25（2）：40.