术前区域性动脉灌注化疗对晚期乳腺癌MVD、MLVD的影响
作者：马小军，何建苗，蒲永东，倪量宏，贾鸿兴
【摘要】 目的 探讨术前区域性动脉灌注化疗对晚期乳腺癌微血管密度（MVD）、微淋巴管密度（MLVD）的影响。方法 将76例晚期乳腺癌随机分为两组，术前局部动脉灌注化疗（A组)35例和术前全身静脉化疗（B组）41例，另选25例未行术前化疗的Ⅲ期乳腺癌作对照组。采用免疫组化SP法，用CD34、血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)抗体对3组组织标本进行MVD、MLVD检测。结果 A组MVD为36.05±13.64，B组为49.92±12.90，对照组为60.38±13.54，各组间比较差异均有高度显著性（P<0.01）；A组MLVD为6.62±3.70，B组为9.96±4.57，对照组为11.30±5.32，A组与对照组、B组比较差异有高度显著性（P<0.01），B组与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。结论 术前区域性动脉灌注化疗能有效地降低肿瘤组织及其周边组织内MVD和MLVD，从而抑制肿瘤细胞生长，减少肿瘤转移的机会。
【关键词】 乳腺肿瘤；动脉灌注化疗；微血管密度；淋巴管密度
乳腺癌是危害我国女性的主要恶性肿瘤之一，目前对乳腺癌的主要是以手术为主的综合性治疗。术前区域性动脉灌注化疗，通过选择性滋养动脉内给药，使肿瘤组织被“浸泡”在高浓度的药物中，起到直接靶向地杀灭肿瘤细胞的作用，具有明显缩小肿瘤原发灶，降低肿瘤分期，从而提高手术切除率，并能抑制手术后残留癌细胞的生长和增殖的优点。并且较全身静脉化疗具有更小的毒副作用，可以反复多次给药，已广泛地应用于实体肿瘤的治疗［1］。笔者对我院76例晚期乳腺癌患者术前分别给予局部动脉灌注化疗和全身静脉化疗，观察术前区域性动脉灌注化疗对乳腺癌微血管密度（microvessel density，MVD）、微淋巴管密度（microlymphatic vessel density，MLVD）的影响。现将结果报告如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组病例为人民解放军总第二附属医院普外科2003年6月～2006年6月收治的晚期乳腺癌患者，均为女性，年龄32～79岁，平均45.5岁。病灶位于左侧乳腺41例，右侧35例。其中外上象限39例，内上象限21例，外下象限9例，乳晕区7例。肿瘤直径5.2～10.6cm，平均6.8cm。本组有62例同侧腋窝淋巴结肿大，且部分融合成团；36例胸肌及皮肤受侵犯，活动度差；8例皮肤破溃；2例出现胸腔积液（其中1例合并心包积液）；6例出现肝、肺转移。全部病例按TNM分期：Ⅲ期59例，Ⅳ期17例。病理类型：浸润性导管癌37例，腺癌14例，乳头状癌9例，单纯癌8例，硬癌6例，湿疹样癌2例。所有病例随机分为两组：术前局部动脉灌注化疗（A组）35例，术前全身静脉化疗（B组）41例。两组患者年龄、病理类型、肿瘤分期比较差异无显著性（P>0.05），具有可比性，见表1。另选同期入院的25例未行新辅助化疗便行乳腺癌改良根治术Ⅲ期乳腺癌病人手术切除标本作对照。
表1 两组患者临床一般资料对比（略）
两组比较，P均>0.05
1.2 置泵及化疗方法 A组病人取平卧位，常规消毒患侧腋窝，用1％利多卡因局麻，取胸大肌外侧缘中点至腋窝顶斜行切口，切开皮肤、皮下长约4cm，寻找到胸外侧动脉，动脉远端结扎，近端逆行插入化疗泵导管。插入深度因人而异，一般插至胸锁关节附近，插管成功后用1％亚甲蓝10ml从导管内注入，同时压迫远端腋动脉，观察肿瘤区域及腋窝染色满意后，固定并保留导管，连接泵体，并将泵体留置皮下。化疗方案为氟尿嘧啶脱氧核苷（FLO）0.5g+吡柔比星（EPI）30mg泵内注入，隔日1次，5次为1个疗程，休息2周后重复，共2～3个疗程。动脉内灌注给药时，在患侧上臂最高处用血压袖带加压至最高收缩压以上，以防药物进入上肢远端。B组不行上述插管置泵，化疗方案（药物、剂量、疗程）与A组相同，给药途径为外周静脉内滴入。以上两组病人均于化疗结束后观察肿块缩小情况、活动度及腋窝淋巴结的状况。间隔4～5天后，行乳腺癌改良根治术或姑息性切除术。对照组术前未给予任何放、化治疗，诊断明确后直接行乳腺癌改良根治术或姑息性切除术，术后给予放化疗。所有切除肿瘤组织标本常规送病检查和免疫组化检测。
1.3 实验方法
1.3.1 组织标本的处理和免疫组化染色 手术切除的肿瘤组织标本经10％的中性甲醛固定，石蜡包埋后，制成4～5μm的连续切片，选择典型切片用于免疫组化染色。所用抗体包括抗CD34单克隆抗体（ZM-0046，北京中杉公司，稀释度1∶100），抗VEGFR3多克隆抗体（兔源，ZA0267，北京中杉公司，工作液）。免疫组化染色采用SP法（SP试剂盒为Santa Cruz公司产品）。切片行微波抗原修复，按SP法进行染色，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。用已知阳性组织作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3.2 免疫组化结果判断 CD34结果判定以血管内皮细胞的细胞质内或细胞膜出现棕黄色颗粒者为阳性，不着色者为阴性。在显微镜低倍视野下于肿瘤细胞浸润区域选取微血管内皮细胞染色清晰，背景对照良好，数量最密集的3个视野，在200倍视野范围分别所有染色的微血管，单个内皮细胞着色亦作为一个计数单位，不论是否形成血管管腔或管腔内有无红细胞。取3个视野的平均值作为MVD值。血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)阳性脉管判断标准及记数方法：低倍镜下寻找VEGFR3阳性脉管密集区，即“热区”，100倍视野计数10个热区中VEGFR3（+）脉管数，取平均值作为MLVD值。肿瘤区内单个或成丛的内皮细胞，不管成腔与否均视为脉管并计数，凡伴有肌层的脉管不予计数。
1.3.3 疗效判断标准 按WHO抗肿瘤药物客观疗效的标准评价［2］。完全缓解（CR）：病灶或胸腔积液完全消失1个月以上；部分缓解（PR）：肿瘤体积缩少50%或腔腔积液量减半维持4周以上；无变化(NC)：肿瘤体积缩小不及50%或增大未超过25%，胸腔积液量减少不超过50%或增加不到25%。进展期(PD)：1个或多个病灶增大≥25%，或出现新病灶。
1.3.4 统计学分析 本组所有数据均采用CHISS统计软件处理，计数资料采用χ2检验，两组间计量资料比较用t检验，多个样本间的两两比较采用方差分析。
2 结果
2.1 临床疗效 A、B两组术前经化疗后，肿块明显缩小变软，腋窝淋巴结缩小或消失，两组疗效比较差异无显著性(P>0.05)，见表2。但A组肿块缩小度比B组更明显（分别为2.758±0.932cm，2.212±0.839cm），两组差异有高度显著性（t=2.69，P<0.01）。
表2 两组患者术前化疗后临床效果对比（略）
u=1.813，P>0.05
2.2 化疗并发症 术前A组和B组两组病人化疗中出现的并发症主要有消化道症状、骨髓抑制、脱发，其它如置泵侧上肢疼痛、静脉炎等，见表3。A组并发症总发生率低于B组(P<0.01)。出现并发症病例均给予升白细胞、延长间隔时间、对症治疗等处理后顺利完成全部化疗疗程。
表3 两组病人化疗并发症对比（略）
与B组比较，a：χ2=7.16，P<0.01
2.3 局部动脉灌注化疗对MVD、MLVD的影响 CD34阳性主要表达在血管内皮细胞，呈现棕黄色颗粒，染色程度均匀一致，微血管分别呈异质性，微血管多位于肿瘤细胞浸润的前缘部位（见图1）。三组间MVD两两比较差异均有高度显著性（P<0.01）。VEGFR3阳性染色为胞浆或胞膜呈明显的棕黄或棕褐色，主要位于上皮下的脉管内皮细胞，管腔多为单层，壁薄，腔内偶见血细胞，在肿瘤组织实质内反应较弱，主要定位于肿瘤的间质内（见图2）。A组与对照组、B组比较显著下降（P均<0.01）。而B组与对照组比较差异无显著性（P>0.05），见表4。
3 讨论
3.1 术前辅助化疗优点 术前化疗又称新辅助化疗，对不能切除或切除困难的晚期乳腺癌采用新辅助化疗具有以下优点：可以降低肿瘤分期，提高手术成功率；消灭微小转移灶，减低肿瘤细胞活力，减少远处播散机会；防止耐药细胞株的形成，了解肿瘤对化疗的敏感性，指导术后辅助化疗方案的选择［3］。而局部灌注化疗更是以其局部药物浓度高，全身毒副作用轻已广泛引用于实体肿瘤的［4］。目前国内外有应用DSA插管至锁骨下动脉给药行晚期乳腺癌术前化疗的研究报道［5，6］。但该方法有操作复杂、不能反复给药等缺点。而术前选择性动脉内置泵灌注化疗具有操作相对方便、置管更准确、留置导管可反复多次经泵体注入给药等优势［7］。术前选择性动脉灌注化疗在肿瘤滋养血管未受到手术破坏前，以高浓度化疗药物进入肿瘤内部，可使药物与肿瘤细胞充分接触，导致肿瘤细胞大量死亡。本研究中病检查发现动脉灌注化疗患者标本中有大量的癌细胞核固缩碎裂，胞浆凝固，细胞间质水肿，细胞坏死；炎性细胞浸润、纤维组织增生；血管内膜增生，血栓形成；而静脉化疗患者出现上述现象较少。本研究充分表明术前选择性动脉灌注化疗比全身静脉化疗具有更高的临床疗效，肿块能明显缩小（P<0.01），两组的完全缓解率分别为34.29％、14.63％；化疗并发症更少。
表4 动脉灌注化疗对乳腺癌MVD、MLVD的影响（略）
与对照组比较，a：t=6.83，c：t=4.02，e：t=3.14，P均<0.01;f：t=1.09，P>0.05;与B组比较，b：t=4.55，d：t=3.46，P均<0.01
图1 乳腺癌组织中 CD34阳性的血管×200（略）
图2 乳腺癌组织中VEGFR3 阳性的淋巴管×200（略）
3.2 肿瘤的生长、浸润、转移及复发与肿瘤的血管、淋巴管形成的关系 肿瘤MVD是衡量肿瘤血管形成程度的标志，肿瘤的生长依赖于肿瘤的新生血管提供营养，抑制肿瘤血管的形成不但能造成肿瘤细胞的坏死，而且可以抑制肿瘤生长以及经血液途径转移。CD34特异性表达于血管内皮，作为检测肿瘤微血管和判断肿瘤预后的有效方法和重要指标，已在临床研究中广泛使用。而MLVD是衡量肿瘤淋巴管形成的标志［8，9］，肿瘤的新生淋巴管在肿瘤的淋巴转移中具有举足轻重的作用，抑制乳腺癌新生淋巴管的生成，可以有效抑制乳腺癌特别是晚期乳腺癌的淋巴转移。VEGFR-3也称作flt4，是第一个被克隆的淋巴管内皮标记物，是VEGF-C的特异性受体。Kaipainen等［10］实验发现，在胚胎期VEGFR3定位于发育中的静脉和淋巴管，但在胚胎后期及成人组织中，VEGFR3主要定位于淋巴管，由此提出，VEGFR3可作为淋巴管的一种特异性标记物。通过检测VEGFR3可以区分肿瘤中的微血管及微淋巴管，阳性染色作为MLVD的依据，其与一样具有重要意义。最近研究发现［11，12］，实体肿瘤胃癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、甲状腺癌等肿瘤细胞能产生多种血管内皮生长因子（VEGF家族），通过与血管内皮受体2（VEGFR2/flk1）或VEGFR3/flt4结合，以旁分泌的方式刺激肿瘤血管、淋巴管生成及通透性增加，促进肿瘤细胞进入血管、淋巴管，增加转移的可能性。术前化疗能使肿瘤细胞大量死亡，减低肿瘤细胞活力，大大减少肿瘤细胞产生的各种血管内皮生长因子，从而有效地降低肿瘤组织的MVD、MLVD，是抑制肿瘤转移的机制之一［13］。本研究中两组MVD与对照组比较均有明显降低。提示新辅助化疗能明显减少肿瘤新生血管的形成，破坏肿瘤的滋养血供，从而造成肿瘤细胞的大量死亡，有效抑制肿瘤细胞的生长、减弱肿瘤细胞的侵袭力，以及减少肿瘤经血管转移的机会。本研究还发现，术前动脉灌注化疗能有效降低肿瘤MLVD，而常规静脉术前化疗则对MLVD影响不大。可能是术前动脉灌注化疗以其药物直接作用于肿瘤细胞，药物高浓度持续作用等特性，一方面以更加有效抑制乳腺癌细胞增殖，减少肿瘤组织的耗氧量，改善组织局部缺氧，从而抑制各种促血管生长因子及淋巴管生长因子的分泌和表达，使肿瘤组织及其周边组织新生淋巴管形成减少，从而使MLVD降低。另一方面，高浓度化疗药物的“浸泡”造成肿瘤细胞大量坏死的同时也引起血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞的坏死脱落，造成肿瘤组织内原有的血管和淋巴管的进一步减少，MLVD降低。
总之，术前动脉内灌注化疗通过选择性滋养动脉内给药，使肿瘤组织被“浸泡”在高浓度的药物中，起到直接靶向地杀灭肿瘤细胞的作用，具有明显缩小肿瘤原发灶，降低肿瘤分期，从而提高手术切除率，并能降低肿瘤组织及其周边组织内MVD和MLVD，从而抑制肿瘤细胞生长，减少肿瘤转移的机会，并且较全身静脉化疗具有更小的毒副作用，可以反复多次给药等优点。术前动脉内灌注化疗是治疗晚期乳腺癌的有效途径。
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