慢性应激抑郁模型大鼠脑内去甲肾上腺素转运体基因表达的变
作者：唐建军，张印南，张金玲，许崇涛
［摘要］目的：探讨慢性不可预见性应激抑郁模型大鼠脑内去甲肾上腺素转运体(NET)基因表达的变化。方法：40只SD雄性大鼠随机分为正常对照组和抑郁模型组。在建立慢性不可预见性应激抑郁模型后，应用动物行为分析系统记录大鼠自主活动的变化，用逆转录_聚合酶链反应法测定NET mRNA的含量。结果：实验后第21d，抑郁模型组的活动时间、总路程明显减少(P<005)，休息时间明显延长(P<005)，脑桥NET基因表达明显下降(P<005)。结论：抑郁模型大鼠脑桥NET基因表达下降可能与抑郁障碍发病有关。 ［关键词］抑郁障碍；慢性应激；去甲肾上腺素转运体；逆转录_聚合酶链反应法
［Abstract］Objective：To investigate the expression change of brain norepinephrine transporter(NET)mRNA in rats treated with chronic unpredicted mild stress. Methods：Male Sprague_Dawley rats were randomly divided into normal control group and depression model group. Chronic stress depression rat model was established and then the autonomic behavior was measured by animal behavior analysis system. The expression of mRNA coding for NET was assayed by reverse transcription_polymerase chain reaction. Results：After unpredicted mild stressors, the motive time and distance were significantly decreased(P<005), and the resting time was significantly prolonged(P<005), the expression of NET mRNA in pontine tissue was significantly decreased(P<005)in depression model group, compared with normal control group. Conclusion：The decreased expression of NET mRNA in pontine might be associated with the etiology of depressive disorder.
［Key Words］depressive disorder; chronic stress; norepinephrine transporter; reverse transcription_polymerase chain reaction
随着对抑郁障碍的深入研究，发现除5_羟色胺(5_HT)系统功能不足外，去甲肾上腺素(NE)系统的功能低下也是构成抑郁障碍的病理生理基础之一。NE再摄取位点即NE转运体(NET)位于神经末梢突触前膜，其功能是重摄取突触间隙的NE进入突触前膜，终止NE对突触后膜受体的作用。NET是多种抗抑郁药物的作用靶点，抗抑郁药物可通过阻断NET以提高胞外NE浓度，延长NE对神经元突触后膜受体的作用时间而达到抗抑郁效果［1］。因此NET对去甲肾上腺素能神经传递起着重要作用，它的基因表达变化有可能与抑郁障碍的发病机制有关。本实验在建立慢性不可预见性应激的抑郁大鼠模型基础上，采用逆转录_聚合酶链反应法(RT_PCR)，观察抑郁模型大鼠脑内NET mRNA表达的变化。
1 材料与方法
11 动物
成年Sprague_Dawley(SD)雄性大鼠(中山大学医学院实验动物中心提供)40只，2月龄，体质量(200±12)g。实验前每笼5只饲养1周［动物房室温(20±2)℃，明/暗交替环境，自由进食、饮水］。1周后开始实验，单笼饲养。将其随机分为正常对照组(20只)和抑郁模型组(20只)。
12 试验方法
121 应激过程
抑郁模型组每日随机安排1种应激(行为限制2h、4℃冰水游泳5min、禁食、禁水各24h、夹尾1min、明/暗颠倒24h、电击足底5min、鼠笼倾斜45° 24h、潮湿垫料10h、空瓶放置1h和45℃高温5min)，连续21d［2］。正常对照组不接受任何应激，自由进食、饮水。实验期间，每周称重大鼠。
122 自发活动测定
用DigBehv动物行为视频跟踪分析系统(上海吉量软件科技有限公司，)测定实验前和实验后第21d大鼠的自发活动(检测在9∶00～11∶00AM进行，时程5min)。自发活动在开放场(40cm×40cm×65cm)进行，由摄像系统和视频合成器记录大鼠的活动情况，机分析系统分析大鼠的运动轨迹，监视、分析休息及活动时间、总路程、线性度、平均速度、中央区域活动时间及路程、四周活动(四角和四边)时间及路程的行为改变。
123 脑内mRNA测定
用RT_PCR测定①总RNA抽提。实验后(第21d)两组同时断头取脑，冰上分离出下丘脑、海马、额叶和脑桥，抽提组织总RNA，用40μL无核酸酶的水稀释RNA沉淀。用BioPhotometer蛋白核酸定量测定仪(Eppendorf公司，德国)测吸光度值(A260/A280)和RNA浓度。②引物合成。由上海生工公司根据设计合成NET和β_肌动蛋白(β_actin)cDNA引物［3］。所有引物序列均经PCR_PLAN软件分析，确认其序列与相应目的基因的同源序列无互补性。NET的上游引物P1为5′_CATCAACTGTGTTACCAG_TTTTATT_3′；下游引物P2为5′_AACATGGCCAGAAGAAAGGTACC_3′，PCR扩增产物长度为334bp的DNA片段。β_actin的上游引物P3为5′_ACACTGTGCCCATCTACGAGG_3′；下游引物P4为5′_AGGGGCCGGACTCGTCATACT_3′，PCR扩增产物长度为623bp的DNA片段。③RT_PCR反应参数。通过退火温度和循环数的调整，依据美国Promega公司逆转录试剂盒(编号A3500)步骤，确定RT_PCR反应参数。逆转录模板RNA为1μL(质量浓度1g/L)，加入Oligo dT_Adaptor Primer 1μL，RNase Inhibitor 05μL，10×RNA PCR Buffer 2μL，Reverse Transcrptase 1μL，MgCl2 4μL，dNTP 2μL(均为10mmol/L)；再加无核酸酶水至终体积为20μL。反应条件：42℃ 15min、95℃ 5min、0℃ 5min。以β_actin为内参照，用PCR扩增目的基因。反应体系：逆转录产物5μL，10×RNA PCR Buffer 245μL，各引物均为05μL(终浓度20pmol/L)；Taq酶(5u/μL)0125μL，MgCl2 18μL，加灭菌蒸馏水至总体积为25μL。起始变性95℃ 3min，然后执行如下反应条件：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环，72℃最后延伸7min，10℃保存。④PCR产物电泳及定量分析。取PCR产物5μL，加DNA上样缓冲液1μL，于质量分数2%琼脂糖凝胶中电泳，70mV下电泳80min。AlphaEaseFC凝胶扫描成像系统对电泳条带进行密度扫描，计算目的基因RT_PCR产物吸光度值与看家基因β_actin RT_PCR产物吸光度值之比值，作为目的基因mRNA的相对含量。
124 统计学处理
用SPSS 115统计软件进行数据分析。计量资料用±s表示，两组指标比较用t检验，方差不齐时用t′检验。
2 结果
21 自发活动测定结果
抑郁模型组实验后第21d与正常对照组比，自发活动有明显改变(表1)。表1 两组自发活动的比较（略）
22 总RNA测定结果
用BioPhotometer蛋白核酸定量测定仪测出的脑组织所提取的总RNA浓度为(05～20)μg/μL，A260/A280在18～20之间，表明RNA相对分子质量完整，无降解、无污染。
23 RT_PCR产物确认
用RT_PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳分析，所得片段大小与报道一致［3］(图1)。图1A、1B分别为NET和β_actin mRNA在脑桥处的表达，电泳条带清晰可见，能正常分析。图1C为NET mRNA在额叶处表达，电泳条带微弱，甚至没有，无法分析。β_actin mRNA在额叶处的表达正常，条带清晰。NET mRNA在海马和下丘脑的表达和额叶基本相同，几乎无电泳条带，无法正常分析。
24 脑桥NET mRNA含量
经β_actin校正后的结果显示，抑郁模型组实验后第21d脑桥NET mRNA的表达与正常对照组比明显下降(P<005)(图2)。
3 讨论
研究显示NE系统神经功能低下与抑郁障碍的发病有密切关系［4］。脑桥是参与调节睡眠、觉醒、记忆力、注意力行为的重要结构，脑内去甲肾上腺素能神经元胞体主要分布在脑桥的蓝斑核，通过纤维投射分布到下丘脑、海马和额叶等脑区。NET mRNA仅分布在去甲肾上腺素能神经元上，脑内其他类型的神经元不表达NET［5］。本实验中，无论抑郁模型组还是正常对照组，在下丘脑、海马和额叶处用RT_PCR法均检测不到NET mRNA表达，这是因为只有神经元胞体内才具有合成蛋白质的结构，而核糖体却几乎不存在于轴突和神经末梢内。去甲肾上腺素能神经元的胞体主要集中在脑桥，因此在下丘脑、海马和额叶处几乎无NET mRNA表达。NET蛋白在蓝斑核处合成后，以顺向轴突运输的方式分布到支配各个脑区的神经纤维末梢，发挥重吸收NE的作用［6］。
本实验采用慢性不可预见性应激抑郁大鼠模型，模拟人类慢性、低水平的应激源所致抑郁障碍来研究脑内NET，在受体水平探讨抑郁障碍发病的神经生化机制。结果显示，慢性轻度不可预见性应激结合单笼喂养21d后，大鼠的自主行为明显减少，表明大鼠已出现行为性抑郁，同时其脑桥NET mRNA表达明显降低。在对大鼠反复的束缚应激后，发现NET结合位点在蓝斑处明显减少［7］。Rusnak等［8］对大鼠经过40d的慢性应激后，用原位杂交法检测NET mRNA表达，发现其表达明显下降。我们使用慢性不可预见性应激的大鼠模型，研究结果与其一致，提示脑桥NET表达的变化与慢性应激所致抑郁的发生密切相关。慢性不可预见性应激抑郁大鼠脑桥NET下降的机制目前并不清楚。Cubells等［9］给予大鼠利血平以耗竭NE、5_HT，24h后NET mRNA表达在蓝斑核处明显下调。快眼动睡眠剥夺(REMSD)作为抑郁障碍的一种快速方法，有可能通过改变NET的表达起效。有学者发现正常大鼠进行REMSD 72h后，NET mRNA表达明显增加［10］。Lee等［11］给予大鼠18d单胺氧化酶抑制剂，提高了突触间的NE浓度，NET的表达也随之增加。以上研究表明，NET mRNA在脑桥处表达降低也许是对突触间隙NE浓度低的一种代偿性适应，慢性应激抑郁大鼠脑内NET基因表达降低可被看作是去甲肾上腺素能神经元的“自我抗抑郁效应”，以便尽可能维持去甲肾上腺素能的神经传递。
应用慢性不可预见性应激的抑郁模型，我们先前的研究显示大鼠的自主活动量与海马5_HT含量呈平行关系，大鼠的抑郁样行为出现伴随着海马5_HT含量明显减少。而本实验也显示行为性抑郁大鼠脑桥的NET mRNA表达明显降低，这进一步表明慢性不可预见性应激的抑郁模型动物具有生物学基础，对抑郁障碍研究是一种理想的动物模型。
文献：
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