N_苄基氟哌啶醇氯化物对大鼠血管平滑肌细胞内钙离子的影响

           作者：黄展勤，石刚刚，方欢，刘幸平，郑锦鸿，高分飞，周燕琼，张艳美  

【关键词】  氟哌啶醇；血管平滑肌细胞；钙；激光扫描共聚焦显微镜

    ［摘要］目的：动态观察N_苄基氟哌啶醇氯化物(F3)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞内Ca2+的影响。方法：用Ca2+荧光染料Fluo_3_AM负载大鼠胸主动脉平滑肌细胞，在激光扫描共聚焦显微镜上测定细胞内游离钙的变化。结果：在含CaCl2(126mmol/L)的细胞外液中，30mmol/LKCl使细胞内钙荧光强度(FI)迅速增强，F3可以拮抗KCl诱导钙FI增强作用，并呈量效依赖和时间依赖关系。4种浓度F3(001、01、10、10 μmol/L)作用3min时，使KCl诱导细胞内钙FI从(81±4)%分别降至(71±18)%(n=20，P<005)、(51±12)%(n=20，P<001)、(39±14)%(n=20，P<001)、(28±14)%(n=20，P<001)。钙FI变化最快的时程是在给药后的0～30s。结论：F3通过阻断细胞膜电压依赖性钙通道降低平滑肌细胞内钙浓度，这可能是其扩张血管，改善心肌缺血的机制。

　　［关键词］氟哌啶醇；血管平滑肌细胞；钙；激光扫描共聚焦显微镜

　　［Abstract］Objective: To investigate the effects of N_benzyl haloperidol chloride(F3)on intracellular calcium(［Ca2+］i)in vascular smooth muscle cells(VSMCs)isolated from thoracic aortas of rat. Methods: VSMCs were loaded with a calcium sensitive fluorescent dye Fluo_3_AM, and ［Ca2+］i was determined by the use of laser scanning confocal microscope. Results: In the extracellular solution with Ca2+ at the concentration of 126 mmol/L, 30 mmol/L KCl induced a rapid increase of intracellular calcium fluorescence intensity(FI). F3 antagonized the increase of FI induced by KCl in both concentration dependent manner and time dependent manner. After 3 minutes of the administration of F3 at the concentration of 001, 01, 10, 10 μmol/L, the increased FI of the VSMCs induced by KCl was decreased from(81±4)% to(71±18)%(n=20, P<005)，(51±12)%(n=20, P<001)，(39±14)%(n=20, P<001)，(28±14)%(n=20, P<001), respectively. During 0～30seconds after the administration of drugs, the changes of FI were more ra_pid. Conclusion: F3 reduces［Ca2+］i via inhibition of voltage dependent calcium channel, which is possibly involved in the mechanism of its vasodilatory and anti_myocardial ischemic effects.

　　［Key Words］haloperidol; vascular smooth muscle cell; calcium; laser scanning confocal microscopy

　　有报道，氟哌啶醇(hal)在离体动物实验中具有扩张血管的作用［1］，临床上hal可使变异性心绞痛患者症状减轻，心电图的缺血性改变得以显著改善［2］。为避免其中枢的不良反应，本室对hal进行了结构改造，通过与氯苄反应，得到氟哌啶醇季铵盐衍生物――N_苄基氟哌啶醇氯化物(F3)。F3为离子型化合物，可拮抗KCl诱导的猪冠状动脉螺旋条收缩，对血管加压素引起的豚鼠冠状动脉灌流量减少有明显的对抗作用［3］；在整体条件下，能对抗血管升压素所致大鼠心电图的缺血改变［4］。这些研究结果提示F3可能成为新型的扩血管药物，其作用可能与阻断血管平滑肌细胞(VSMCs)膜电压依赖性钙通道从而使细胞内Ca2+浓度减少有关。本文采用激光扫描共聚焦显微镜技术，探讨F3对VSMCs胞浆游离钙离子浓度(［Ca2+］i)的影响。

　　1 材料与方法

　　11 动物

　　Sprague_Dawley(SD)大鼠(汕头大学医学院动物中心提供)42只，体质量100～120g，雌雄不拘。

　　12  细胞培养

　　VSMCs培养见［5］。

　　13 药物与仪器

　　KCl(广州化学试剂厂)用Ｍ199培养基配制；Ｆ3为本室合成；维拉帕米(基诺药厂，德国)；Fluo_3_acetoxymethyl(Fluo_3_AM，分子探针公司，美国)；TcsNT激光扫描共聚焦显微镜(Leica公司，德国)；DiphotTMD型倒置显微镜(Nico公司，美国)；CO2孵箱(Sanyo公司，日本)；Petri皿(基因公司，美国)。

　　14 荧光染料的配制［7］

　　取Fluo_3_AM(1mmol/L)，用Ｍ199溶液将其稀释成10μmol/L。

　　15 细胞染色［7］

　　把Petri皿中培养过细胞的培养液倒掉，用Ｍ199溶液漂洗2次，取01mL(10μmol/L)Fluo_3_AM加到Petri皿中，于37℃，体积分数5%CO2培养箱内孵育30min，用Ｍ199溶液漂洗3次，加入800μＬ(含126mmol/LCaCl)Ｍ199溶液，上机测量。

　　16  细胞内Ca2+变化的检测［7］

　　将染好色的细胞放在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，用氩离子激光预扫描，设置以下各种条件：荧光探针激发波长488nm，发射波长530nm；扫描方式：时间扫描；扫描密度(分辨率)：512×512×60；物镜倍数：20；放大(zoom)倍数：2；激光功率：30mW；光电倍增管(PMT)：750；时间间隔：5s；连续扫描5min。预扫描时调节聚焦平面使图像清晰，正式扫描到第5幅图像时加入实验药物进行检测。然后选择细胞，记录细胞内荧光强度(FI)的变化并由机进行处理，得到［Ca2+］i变化(相对FI值)的时间效应曲线。实验所测染色条件和激光扫描参数在整个实验过程中不变，每个实验组先后测定3次，图形均基本一致。数据经TcsNT微机系统对图形及时间进行实时测量而获得，以终浓度为30mmol/LKCl诱导的钙FI的峰值为100%，加入不同浓度药物后不同时间钙FI的变化为峰值的相对值。

　　17  统计学处理

　　钙FI值以±ｓ表示，方差分析。

　　2 结果

　　21 KCl诱导的VSMCs内钙FI的变化

　　加入终浓度30mmol/LKCl溶液，FI迅速升高并达到峰值，然后缓慢下降并持续维持在一个较高水平，3min时其值为(81±4)%(n=20)(图1，封2)。

　　22  F3和维拉帕米对KCl诱导的VSMCs内钙FI的影响

　　在KCl(30mmol/L)诱导的［Ca2+］iFI达峰值后分别加入001、01、10、10μmol/LF3后，由KCl诱导的［Ca2+］iFI出现持续性下降(图2，封2)，并呈浓度依赖关系(图3，封2)。钙FI变化最快的时程是在给药后的0～30s，维拉帕米(10μmol/L)对KCl诱导的VSMCs内钙FI的降低作用与F3(10μmol/L)的作用基本相似(表1)。表1 F3对KCl诱导的VSMCs内钙FI的影响（略）

　　3  讨论

　　Fluo_3_AM是Ca2+的敏感探针［8］，结合激光扫描共聚焦显微镜技术的应用，使其能快速精确反映活细胞内Ca2+的动态变化，因而近年来得以广泛应用［9］。本实验采用这一技术观察F3对VSMCs内Ca2+浓度的影响，探讨F3扩张血管的机制。

　　实验中，在含钙工作液中，KCl可使大鼠VSMCs内钙FI迅速增强，说明KCl使VSMCs电压依赖性Ca2+通道打开，Ca2+迅速内流。结果表明001、01、10、10μmol/LF3浓度依赖地抑制KCl诱导VSMCs内钙FI增强的效应。这与以前观察到F3对抗KCl诱导的冠状动脉螺旋条收缩的效应相一致，说明F3扩张血管的机制可能与通过阻断平滑肌细胞膜钙通道有关。

　　本研究在动态观察F3的作用时发现，加入F3后，细胞内钙FI迅速发生变化，终浓度为10μmol/LF3和10μmol/L维拉帕米均可使钙FI在30s内迅速下降，此段时间内钙FI下降的幅度最大，到60s降到较低水平，60s以后速度减慢，并逐渐维持在最低水平。这提示我们用本实验方法观察药物对细胞内Ca2+的作用要注意钙FI的变化速度可能是快而短暂的，所以要设置适当的激光扫描速度和间隔时间，否则可能会捕捉不到药物的作用，甚至会出现假阴性结果。

　　：

　　［1］石刚刚，马希贤，陈锦香，等.氟哌啶醇对猪冠状动脉螺旋条作用的研究［J］.药学杂志，1996，31(3)：142-144.

　　［2］石刚刚，郑锦鸿，陈少刚.氟哌啶醇不稳定性心绞痛病例分析［J］.汕头大学医学院学报，1997，10(2)：33-35.

　　［3］石刚刚，郑锦鸿，李长潮，等.氟哌啶醇化学衍生物对冠状动脉作用的研究［J］.中国病理生理杂志，1998，14(6)：641-643.

　　［4］庄学煊，陈少刚，黄展勤，等.氟哌啶醇季铵盐衍生物对大鼠心肌缺血的保护作用［J］.汕头大学医学院学报，2001，14(3)：172-173.

　　［5］Batra VK，McNeil JR，Xu YJ，et al.BTB receptors of aor_tic smooth muscle cells of spontaneous hypertensive rats［J］.Am J Physiol，1993，264：C479-C845.

　　［6］Naik RD，McNeil JR，Wilson TW，et al.Nuclear signaling to endothelin_1 in rat aortic smooth muscle［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，1998，31(Suppl)：S199-S202.

　　［7］Li N，Shao HY，Lu QG.Effect of nifedipine on intramyocy_tic calcium fluxion of cultured rat soleus muscle cells examined by laser scanning confocal microscopy［J］.Chin J Stereol I_mage Anal，1998，3：224-227.

　　［8］Harootunian KJ，Tsien RY.Photochemistry generated cytosolic calcium pulses and their detection by Fluo3［J］.J Biol Chem，1989，264(14)：8179-8184.

　　［9］Kanistanaux D，Burrill PH.Confocal Fluorescence Microscopy：A New Dimension［J］.Biomed Prod，1989，54：72-76.