RhoA在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖中的作用
作者：吴宝安，梁力建，李威，宋香茹
【关键词】 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂；HepG2细胞；增殖；RhoA
［摘要］目的：探讨RhoA在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖过程中所起的作用。方法：用基因芯片、RT_PCR和Western blot检测洛伐他汀作用前、后HepG2细胞中RhoA的表达。结果：加入洛伐他汀后，mRNA(RhoA)和RhoA蛋白水平均上调；加入香叶基香叶基焦磷酸或法呢基焦磷酸后，RhoA蛋白水平上调被不同程度逆转。结论：减少RhoA香叶酯化，抑制RhoA的细胞膜锚着可能是洛伐他汀抑制HepG2增殖的机制之一。
［关键词］羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂；HepG2细胞；增殖；RhoA
［Abstract］Objective: To study the role of RhoA in lovastatin_inhibited proliferation of HepG2 cells. Methods: The cDNA microarray assay, RT_PCR and Western blot were carried to analyze the mRNA and protein expression of RhoA, respectively. Results: The mRNA and protein expression levels of RhoA were up_regulated in lovastatin_inhibited HepG2 cells. This response could be reversed by addition of geranylgeranyl pyrophosphate or farnesyl pyrophosphate in different degrees. Conclusion: RhoA isoprenylation inhibition and its delocalization from the cell membrane may be one of the mechanisms of lovastatin_inhibited anti_proliferation effect in HepG2 cells.
［Key Words］3_hydroxy_3_methyl glutaryl coenzyme A reductase inhibitor; HepG2 cell; proliferation; RhoA
羟甲基戊二酰辅酶A(HMG_CoA)还原酶抑制剂通称他汀类药物(statins)，广泛用于高脂血症的。近年来statins的抗肿瘤作用日益受到重视。洛伐他汀有诱导头颈部鳞癌、甲状腺癌细胞凋亡的作用［1，2］。口服普伐他汀能延长晚期肝细胞癌患者中位生存期［3］。我们发现，洛伐他汀对人肝癌细胞系HepG2细胞的增殖有抑制作用。RhoA(Ras相似物成员A，Ras homolog gene family，member A)属Rho家族蛋白的Rho亚家族成员，可通过多种信号途径参与调节细胞的生长、凋亡和细胞周期［4］。本研究旨在探讨RhoA在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖过程中的作用。
1 材料与方法
11 主要试剂、仪器
HepG2细胞系由中山大学附属第一外科实验室保存。洛伐他汀、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)和法呢基焦磷酸(FPP)购自美国ALEXIS公司；DMEM培养基(Gibco BRL公司，美国)；胎牛血清（杭州四季青公司，）；TRIzol、SuperScriptTM Ⅱ RNase H-Reverse Transcriptase(Invitrogen公司，美国)；RNeasyKit、QIAquick Nucleotide Removal Kit(QIAGEN公司，德国)；Cy5、Cy3（Amersham公司，英国）；5K基因表达谱cDNA芯片(上海生物芯片公司，中国)；ReverTra Ace_α_TM(TOYOBO公司，日本)；鼠抗人RhoA抗体(Santa Cruz公司，美国，南方医院李湘博士惠赠)；鼠抗人β_actin（武汉博士德公司，中国）；ECL化学发光液（PIRECE公司，美国）。DU800核酸/蛋白分析仪（BECKMAN公司，美国）；PCR仪(Applied Biosystems公司，新加坡)；酶标仪，UVP杂交炉（Thermo公司，美国）；扫描仪(Agilent公司，美国)；凝胶成像分析系统，SYnGENE化学发光、荧光检测数字成像系统(Synoptics公司，英国)；POWER Pac HcTM组合式电泳系统(Bio_Rad公司，美国)。
12 方法
121 细胞培养
洛伐他汀的活化参照Jakobisiak等［5］的方法稍加改进。HepG2细胞在含体积分数10%胎牛血清的DMEM，37℃，体积分数5% CO2，饱和湿度贴壁培养，70%融合时换用无血清DMEM，24h后再换成含体积分数10%胎牛血清的DMEM，并加入相应药物。
122 平板克隆形成试验
制备细胞悬液，按每皿500个细胞的密度接种于100mm培养皿培养2周后用甲醇固定，姬姆萨液染色，光镜下观察。
123 总RNA提取
实验组细胞加入洛伐他汀(20μmol/L)，对照组加等量溶剂。18h后每5×106个细胞加入1mL TRIzol，提取总RNA，用RNea_sy Kit纯化总RNA，核酸/蛋白分析仪检测浓度。样品置于_80℃冰箱中，待作基因芯片和RT_PCR检测。
124 基因芯片检测
cDNA芯片包含有关细胞分化、信号传导、结构、成分、基因和蛋白表达、代谢、假基因等已知功能或者与疾病相关的人类基因5075个，设10个阳性对照和6个阴性对照。采用cDNA直接标记法标记RNA探针，其中实验组以Cy3荧光标记，对照组以Cy5荧光标记，纯化探针。各取30pmol标记后探针42℃与芯片避光杂交16h，然后用1×SSC/质量分数02% SDS(55℃)、01×SSC/02% SDS(55℃)、01×SSC溶液(室温)依次洗片。芯片结果经扫描后读取数据并进行标准化分析，Cy3/Cy5为实验组/对照组的ratio值，差异基因筛选标准是ratio=2为上调基因，ratio=05为下调基因。
125 RT_PCR检测
从两组取等量RNA各1份，用ReverTra Ace_α_TM合成cDNA。根据基因芯片结果，参照GenBank序列，设计引物(primer50软件)由Invitrogen公司合成。RhoA：上游序列5′_CTGGACTCGGATTCGTTG_3′，下游序列5′_TTGGGACAGAAATGCTTGAC_3′；内参照引物：β_actin：上游序列5′_CTGTCTGGCACCACCAT_3′，下游序列5′_GCAACTAAGTCATACTCCGC_3′。PCR反应条件：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，29个循环后72℃ 7min。扩增产物分别长352bp和254bp，经质量分数20%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统行光密度测定。以RhoA与β_actin的光密度比值推测基因表达量变化。重复检测3次。
126 Western blot检测
用预冷NP_40裂解液提取细胞浆蛋白，Brad_ford法检测蛋白浓度。每组30μg蛋白行SDS_PAGE电泳并转印至PVDF膜。按洗膜，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，ECL显色，数字成像系统成像的顺序完成一轮检测。洗脱抗体，同法检测内参照β_actin。以RhoA与β_actin的光密度比值推测蛋白表达量变化。重复检测3次。
127 统计学处理
采用SPSS 110进行统计学分析。数据以±s表示，采用t检验。
2 结果
21 平板克隆形成试验
实验组细胞克隆数及细胞数量明显减少，细胞变小(图1，封4)。
22 基因芯片检测结果
共检出洛伐他汀作用后表达上调的基因30个，表达下调的基因11个。其中RhoA的实验组/对照组的ratio值为2874。
23 RT_PCR检测mRNA(RhoA)
实验组RhoA/β_actin光密度比值为1110±0153，对照组0796±0106(P<005)(图2)，提示洛伐他汀作用后mRNA(RhoA)表达上调，与基因芯片结果一致。
24 Western blot检测RhoA蛋白表达
加入洛伐他汀(20μmol/L)12h后，RhoA蛋白表达随时间的延长而增加(图3A)。加入不同剂量(1、5、10μmol/L)洛伐他汀24h后，RhoA蛋白表达随剂量增加而增加。与单用洛伐他汀(20μmol/L)比，合用GGPP(10μmol/L)RhoA蛋白表达明显减少，合用FPP(10μmol/L)RhoA蛋白表达虽减少，但不如合用GGPP明显(图3B)。
3 讨论
HMG_CoA还原酶是胆固醇生物合成的主要限速酶，催化HMG_CoA合成甲羟戊酸(MVA)。MVA通路的产物在转录后的蛋白修饰中发挥重要作用，以GGPP和FPP尤为重要，分别与Rho的香叶酯化和Ras的法呢酯化有关，GGPP和FPP的异戊烯基修饰使Rho和Ras定位于细胞膜发挥完整的功能［6］。
statins是HMG_CoA还原酶强力和高度专一的竞争性抑制剂，目前认为statins可能通过抑制MVA代谢通路中关键的信号传导蛋白(如Rho和Ras蛋白)转录后的异戊烯化，引起细胞周期的阻滞和细胞信号传导的中断发挥抗肿瘤作用。
Rho家族在一些肿瘤中表达升高［4,7,8］，而del等［9］认为RhoA在胰腺癌组织与正常组织、在转移癌灶中与非转移性癌灶中的表达无差别。Christophe等［10］发现，西力伐他汀明显减少RhoA从乳腺癌MDA_MB_231细胞胞浆到胞膜转移，呈时间_效应依赖关系。本研究表明，洛伐他汀作用后HepG2细胞中RhoA表达上调，且随时间延长、剂量增加而表达增加。我们认为这是因为洛伐他汀能减少RhoA的香叶酯化，定位于细胞膜的香叶酯化RhoA减少，胞浆中未香叶酯化RhoA增加，支持Christophe等的观点。我们的前期研究表明，洛伐他汀抗HepG2细胞增殖和诱导凋亡的作用可被GGPP完全逆转，被FPP部分逆转。本研究中，加入GGPP后RhoA蛋白表达明显减少，而加入FPP则不如GGPP作用明显。推测RhoA的香叶酯化可能比Ras蛋白的法呢酯化在肿瘤的发生中起更大作用。
RhoA异戊烯化对抑制依赖p21Waf/Cipl转录的细胞生长也是必要的［11］。p21Waf/cipl是一种周期素依赖性蛋白激酶抑制剂，由CDKN1A基因编码，能结合并抑制cyclin_CDK2或CDK4复合物，使细胞生长阻滞于G1期［12］。基因芯片检测发现洛伐他汀作用后CDKN1A表达也上调，符合RhoA的变化趋势。本研究用基因芯片对药物作用前、后的基因变化进行初筛，用RT_PCR进一步验证，最后用Western blot在蛋白水平检测RhoA的表达，初步揭示了RhoA在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖过程中的作用。
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