碘化N_正丁基氟哌啶醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤及Egr_1表达的影响
作者：张艳美，石刚刚，黄展勤，高分飞，周燕琼
【关键词】 碘化N_正丁基氟哌啶醇；早期生长反应蛋白_1；心肌；缺血再灌注损伤
［摘要］目的：观察碘化N_正丁基氟哌啶醇(F2)对大鼠心肌组织缺血再灌注(I/R)损伤病理改变及早期生长反应蛋白_1(Egr_1)表达变化的影响。方法：制作大鼠I/R损伤模型。常规病理染色技术观察心肌组织形态学变化。免疫组织化学法测定缺血心肌组织Egr_1阳性表达的细胞数。结果：I/R造成大鼠心肌组织病理损伤，尤以炎症反应为重；I/R诱导心肌组织Egr_1表达上调。缺血前给予F2则能减轻I/R所致心肌组织内的各种病理反应，抑制心肌组织内Egr_1的过表达。结论：F2对大鼠I/R心肌组织损伤具有保护作用，这可能与其抑制Egr_1过表达有关。
［关键词］碘化N_正丁基氟哌啶醇；早期生长反应蛋白_1；心肌；缺血再灌注损伤
［Abstract］Objective: To investigate the relationship between the protective effects of N_n_butyl haloperidol iodide(F2)on myocardial ischemia/reperfusion(I/R)injury and the expression of Egr_1. Methods: The rat myocardial I/R models were established. The pathological changes of myocardial tissue were detected by hematoxylin_eosin staining. The early growth response_1(Egr_1)immunopositive cells were counted by immunohistochemistry. Results: I/R caused pathological injury, especially inflammatory response and induced strong expression of Egr_1 in myocardial tissue. F2 significantly attenuated the myocardial injury and inhibited the overexpression of Egr_1 after I/R. Conclusion: F2 can protect myocardiu_m from I/R injury, which might be related to the inhibition of Egr_1 overexpression.
［Key Words］N_n_butyl haloperidol iodide; early growth response_1; myocardium; ischemia/reperfusion injury
早期生长反应基因_1(early growth response gene_1，egr_1)是一种即早基因，可受多种刺激因素(缺氧、氧化应急、机械损伤)诱导而表达，其翻译产物早期生长反应蛋白_1(Early growth response_1，Egr_1)则是一种具有3个锌指样结构的转录因子，可通过特定序列与DNA结合，启动下游靶基因的表达。研究表明，多种脏器缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后均会出现Egr_1表达上调［1］，而由此引发的多种损伤因子的异常表达又与I/R损伤的主要病理改变如炎症反应、凝血和血管高通透性密切相关，故此有学者提出Egr_1是构成再灌注损伤各种通路的一种共同分子基础［2］。另有报道，细胞内Ca2+浓度升高可引起Egr_1过表达［3］。碘化N_正丁基氟哌啶醇(F2)是我们课题组合成的具有拮抗心肌I/R损伤作用的一个新化合物，其药理机制可能与其阻断心肌细胞和血管平滑肌细胞膜钙通道，防止钙超载有关［4～8］，但F2是否会通过对细胞内Ca2+浓度的调节而影响其Egr_1的表达，尚不清楚。本研究旨在探讨F2对心肌组织I/R病理改变及Egr_1表达变化的影响，以期进一步揭示F2抗心肌I/R损伤的深层分子机制。
1 材料与方法
11 实验动物
健康Sprague_Dawley大鼠(汕头大学医学院动物中心提供)16只，雌雄不限，体质量240～290g。
12 主要试剂和仪器
F2由汕头大学医学院药物研究室化学组合成，结构由院上海有机化学所鉴定。实验前用体积分数35%的聚乙二醇400(PEG 400)(上海化学试剂公司，中国)溶解配成所需浓度；兔抗大鼠Egr_1多克隆抗体(SantaCrutz公司，美国)；即用型SABC免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；DH 140动物人工呼吸机(浙江医科大学仪器实验厂，中国)。
13 急性心肌I/R损伤模型的建立及实验分组
在［6］的基础上稍加改进建立损伤模型：结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血，60min后解除结扎再灌注180min。大鼠随机分为I/R组(4只)(缺血前5min经舌下静注NS 1mL/kg)；PEG 400组(4只)［按I/R组方法，改NS为体积分数35%的PEG 400(1mL/kg)］；F2组(4只)(配成2mg/mL，缺血前5min经舌下静注1mL/kg)；假手术(Sham)组(4只)(手术操作同其它组，冠状动脉前降支穿线，但不结扎；缺血前经舌下静注NS 1mL/kg，持续观察240min)。
14 心肌组织病理观察
实验结束后，取结扎线下厚约2～3mm的缺血区心肌组织，用预冷NS冲洗去血液，滤纸吸干。置于质量分数4%的多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片(片厚4μｍ)。石蜡切片经苏木精_伊红染色后光学显微镜下观察心肌组织形态学变化。
15 免疫组织化学法检测Egr_1表达
再灌注结束后，立即取结扎线下的心肌组织置于4%的多聚甲醛溶液中固定6h，然后移至质量分数30%的蔗糖溶液中，4℃冰箱过夜。组织块沉底后制作心肌组织横断连续冷冻切片(片厚10μｍ)，冷丙酮固定10min。切片采用SABC法进行免疫组化反应：切片置于体积分数3%的H2O2(蒸馏水配制)中，室温7min，蒸馏水洗3次；滴加复合消化液，室温10min，蒸馏水洗3次；滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；滴加Egr_1一抗(稀释度1∶200)，4℃冰箱过夜；001mol/L PBS洗后，滴加生物素化二抗，室温20min；滴加SABC，室温20min，PBS洗涤；DAB显色(时间约5min)，显微镜下控制，苏木精轻度对比染色，脱水、透明、封固。阴性对照片则以抗体稀释液替代一抗进行孵育。40倍光学显微镜下，每张切片随机选取4个视野，计数Egr_1阳性表达细胞数，取各视野的平均值作为该切片的观测值。
16 统计学处理
实验结果用SPSS 110统计软件分析，并以±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较。
2 结果
21 F2对缺血区心肌组织病理变化的影响
苏木精_伊红染色表明，Sham组心肌组织结构清晰，血管内皮未见WBC黏附，周围组织中也无WBC浸润。再灌注3h后，I/R组及PEG 400组缺血区心肌组织内肌细胞间隙出血水肿、心肌纤维肿胀，血管内充血，部分血管内可见均一嗜伊红性染色的梁状结构。同时缺血区心肌组织中可见大量WBC与血管壁黏附并渗出至血管外，组织内亦可见WBC浸润。F2组心肌组织水肿及出血性变化明显减轻，与血管壁黏附的WBC和浸润到实质内的WBC数量均明显减少(图1，封3)。
22 F2对心肌组织内Egr_1表达变化的影响
Sham组心肌组织内仅见少量Egr_1阳性表达的心肌细胞［(53±26)个/视野］；I/R组心肌细胞和冠状动脉微血管均可见明显的Egr_1特异性染色，阳性细胞数［(293±57)个/视野］与Sham组比，有统计学意义(P<005)；PEG 400组心肌组织内Egr_1表达情况基本同I/R组，阳性细胞数［(300±63)个/视野］与I/R组比，无统计学意义(P>005)；F2组心肌细胞和冠状动脉微血管Egr_1的表达强度明显低于I/R组，阳性细胞数［(155±39)个/视野］与I/R组比，有统计学意义(P<005)。阴性对照片未见Egr_1阳性表达(图2，封3)。
3 讨论
我们以往采用不同种属的动物(大鼠或兔)或不同I/R时程(30min/30min,40min/40min,60min/60min)对F2的作用进行研究，发现F2可改善I/R造成的血流动力学变化和酶学变化，缩小心肌梗死面积，表明其具有抗心肌I/R损伤的药理作用［5～7］。由于炎症反应、凝血和血管高通透性是I/R损伤的3大病理改变，其中WBC参与的炎症反应是再灌注组织损伤的重要原因。为观察更典型的炎症反应，本实验特地采用比以往实验更长时程的I/R模型，通过苏木精_伊红染色观察到I/R造成的以上3种病理变化，其中WBC聚集并游走到血管外或心肌组织间隙现象极为明显。而给予F2后，明显减轻了上述变化，由此，F2对I/R心肌组织多方面的保护作用再次得以验证。
资料显示，心、肺、肠、肾等器官再灌注后均会出现Egr_1表达水平上调［1］。Yan等［2］研究发现，在肺60min缺血和180min再灌注模型中，虽然缺血期间肺组织Egr_1表达增高，但再灌注末期Egr_1表达增高更为显著。他们借助egr_1基因敲除技术，进一步发现I/R过程中高表达的Egr_1又可诱导多种下游靶基因的表达，其中包括白介素_1β、巨噬细胞炎性蛋白_2、细胞间黏附分子_1、组织因子、纤溶酶原激活物抑制物_1和血管内皮生长因子等。而这些因子又与I/R损伤的3大病理改变密切相关。为此，Yan等提出了Egr_1是启动缺血性损伤分子开关的观点。Okada等［9,10］利用反义寡核苷酸或egr_1基因敲除技术也证实了Egr_1在I/R损伤分子机制中的中心地位。本研究采用同样时程的心脏I/R模型，发现再灌注180min后，心肌组织中Egr_1蛋白阳性表达细胞数较Sham组显著升高，结果也支持Egr_1过表达参与了I/R损伤的病理过程。而缺血再灌注前给予F2则能抑制Egr_1蛋白的异常表达。结合F2对I/R所致的病理损伤的减轻作用，我们认为F2对I/R心肌损伤的保护作用与其抑制Egr_1的过表达密切相关。本研究结果显示I/R组和PEG 400组之间病理损害相似，Egr_1的表达亦无统计学意义，表明PEG 400对研究结果无影响。
目前关于Egr_1表达的上游机制尚不十分清楚。有报道，细胞内Ca2+浓度升高可引起Egr_1过表达［3］。而我们的前期实验表明F2对I/R心肌的保护作用可能与其阻断细胞膜L型钙通道有关。因此，我们推测F2对Egr_1表达的调节可能是通过阻断Ca2+内流，减少细胞内Ca2+水平这一途径，当然直接的证据有待于进一步研究。
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