梗阻性黄疸大鼠血液中内毒素含量与组织形态学变化

                作者：姜宪，姜旭，申蓉硕，张虎

［摘要］ ［目的］ 探讨梗阻性黄疸大鼠血液中内毒素含量与肝及小肠黏膜的形态学变化. ［方法］ 监测假手术组、梗阻性黄疸1，2周组小鼠血胆红素及内毒素含量，采用光学显微镜及显微镜观察不同时期梗阻性黄疸大鼠肝及小肠黏膜的形态学变化. ［结果］ 梗阻性黄疸1，2周组大鼠血胆红素及内毒素含量明显升高，与假手术组比较有显著性差异，且肝组织损伤随梗阻时间的延长而逐渐加重，但肠道黏膜的损伤则较轻微. ［结论］ 发生梗阻性黄疸时内毒素血症的发生和与肠黏膜的屏障功能密切相关.

　　［关键词］  梗阻性黄疸;内毒素血症;组织学

    ABSTRACT:OBJECTIVE To study the the content of plasma endotoxin and the histomorphological changes of liver and small intestinal membrane caused by obstructive jaundice in rats.METHODS After executing rats in obstructive jaundice groups for1，2weeks and pseudo operative group with bleeding，the content of serum bilirubin and endotoxin was monitored and the histomorphological transformation of the liver and the small intestine was observed in different period of obstructive jaundice by light microscope and electron microscope.RESULTS The content of serum bilirubin and endotoxin in the obstructive jaundice groups for1，2weeks was obviously increased，respectively，and there was significant difference compared with pseudo operative group.The damage of liver was becoming heavier while the obstruction was prolonged，but the damage of the small intestinal membrane was much slighter.CONCLUSION When happening obstructive jaundice，the occurring and the development of endotoxemia is closely correlated with the protective barrier function of small intestinalmembrane in rats.

   　 Key words:obstructive jaundice;endotoxemia;histology 

　 梗阻性黄疸是常见的外科疾病，而因肝网状内皮系统功能受抑制及肠黏膜屏障功能降低所并发肠源性内毒素血症是造成患者死亡的主要原因.本实验通过建立梗阻性黄疸动物模型，动态观察了其血液中内毒素含量与肝及小肠黏膜的形态学变化，探讨了肝网状内皮系统及肠黏膜的屏障功能在梗阻性黄疸所致内毒素血症中的作用.

    1 材料与方法

    1.1 材料  选取健康Wistar雄性大鼠，体重为（215±35）g，由延边大学医学部实验动物科提供.

　 1.2 方法

    1.2.1 动物模型的制作  选取健康Wistar雄性大鼠30只，随机分成3个组，即假手术组及梗阻性黄疸1，2周组，每组各为10只.实验大鼠术前禁食禁水12h，用10g/L氯胺酮按每kg体重100mg的剂量进行腹腔内注射麻醉.梗阻性黄疸1，2周组取上腹部正中切口开腹，沿肝十二指肠韧带找到胆总管，在十二指肠上方用7号线双重结扎胆总管，制作梗阻性黄疸模型;假手术组仅进行腹腔游离，不结扎胆总管.于术后第7，14日取血，处死动物.

    1.2.2 血清胆红素含量的测定  取1mL血液置于试管中，以2500r/min离心10min，取血清，用苯甲酸钠-咖啡因比色法测定血清胆红素含量.

    1.2.3 血液中内毒素含量的测定  采用上海医学研究所提供的鲎试剂盒，按说明制定标准曲线，即将已知内毒素标准曲线稀释至1000.0，500.0，250.0，125.0，62.5，30.0EU/L，使用722型分光光度仪测定各浓度的吸光度，绘制标准曲线.将保存于-20℃条件下的血液在恒温融化，取0.1mL加入到0.2mL Tris-HCl及9g/L氯化钠溶液0.2mL，混匀，置于100℃水浴10min，离心，取上清液0.1mL，测定吸光度，从标准曲线中得出相应的内毒素含量.

　1.2.4 光学显微镜标本的制作  术后1，2周处死动物，立即取大小为2cm×2cm×1cm的肝组织1块，并从回肠末端25cm处切取5cm长的小肠，迅 速将肝及肠组织放入pH值为7.5的100g/L甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片，行HE染色，在OLIMPUS光学显微镜下观察，照相.

    1.2.5 电子显微镜标本的制作  术后1，2周处死动物，立即取大小为1cm×1cm×1cm的肝组织及1cm×1cm的小肠组织各4，5块，迅速放入预冷的30g/L戊二醛溶液中固定，用PBS冲洗，再用10g/L四氯化碳溶液（pH值为7.4）固定，丙酮梯度固定脱水，用丙酮及EPON（812和815混合剂）浸透，再用EPON（812和815混合剂）浸透，聚合，包埋，制作超薄切片，行电子染色，在JEM-1200EX型电子显微镜下观察.

    1.2.6 统计学处理  血胆红素及内毒素含量比较采用方差分析方法.

    2 结果

    2.1 一般状态  胆总管结扎48h后大鼠尿液颜色开始变黄，4～5d时全身皮毛开始转黄，进食量逐渐减少.术后1周及2周，梗阻性黄疸大鼠近肝侧胆总管囊状扩张，肝脏弥漫性肿大，呈黄褐色.

    2.2 血清胆红素含量的变化  梗阻性黄疸1，2周组大鼠血胆红素含量与假手术组相比较明显升高，分别有显著性差异（P<0.05）;梗阻性黄疸1周组血胆红素含量与2周组相比较明显升高，两组间有显著性差异（P<0.05），见表1.

    2.3 血液中内毒素含量的变化  梗阻性黄疸1，2周组大鼠血液中内毒素含量与假手术组相比较有明显增高，有显著性差异（P<0.05），见表1表1 梗阻性黄疸大鼠血清胆红素与血液内毒素含量的变化*与假手术组比较，P<0.05;#与梗阻性黄疸1周组比较，P<0.05 2.4 形态学观察

    2.4.1 光学显微镜观察  假手术组:肝小叶结构完整，无变形及坏死（图1）;梗阻性黄疸1周组:部分肝小叶内可见灶状及小片状坏死（图2）;梗阻性黄疸2周组:肝细胞损伤明显，肝小叶内可见多种形态的坏死灶，其内可见少量纤维细胞增生（图3）.

    2.4.2 显微镜观察  梗阻性黄疸组大鼠小肠

    黏膜细胞线粒体肿胀，嵴断裂（图4）;肝细胞体积增大，胞质密度疏松，各细胞器悬浮于胞质内，线粒体轻度肿胀，滑面内质网扩张，呈大小不同的泡状结构，粗面内质网相对减少，糖原颗粒分布稀疏，细胞核异染色质及常染色质分布不均匀，异染色质轻度边集（图5）;肝细胞之间的毛细胆管明显扩张，部分狄氏腔内可见增生的纤维组织（图6

    3 讨论

    据报道，梗阻性黄疸患者术前发生内毒素血症的比率为24%～68%，是引起此病高死亡率的主要原因 ［1，2］ .内毒素是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁上，具有亲水及亲脂双重特性的基因复合物，主要成分为脂多糖（lipopolys-accharide，LPS）.LPS由3部分组成，即O-特异性多糖、核心多糖及脂类A.梗阻性黄疸内毒素血症发生的主要原因如下:1）由于胆汁不能排入胆道，失去了胆盐对细菌繁殖的抑制和对LPS的降解作用，使细菌异常繁殖，肠道菌群失调，内毒素生成增多，肠黏膜瘀血、水肿、坏死及脱落，绒毛萎缩，黏膜变薄，使大量肠源性内毒素通过已削弱的肠黏膜机械屏障及免疫屏障被吸收进入门静脉;2）肝网状内皮系统明显受抑制，肝枯否氏细胞功能降低，对内毒素的吞噬和降解能力不足，门静脉血中的内毒素泛溢入体循环 ［3］ .实验结果表明，梗阻性黄疸1，2周组大鼠的血液中内毒素及胆红素含量均明显增多，与假手术组比较均有显著性差异，且肝组织的损伤随时间的延长而逐渐加重，提示梗阻性黄疸发生时，可引发内毒素血症，并伴随肝细胞损伤.上述变化机理可能为因肝脏是机体内清除内毒 素的主要脏器，而当发生梗阻性黄疸时肝脏无法清  除血液中内毒素排除到体外，故致内毒素多次损伤肝脏网状内皮系统，导致肝细胞损伤.本实验结果还表明，发生梗阻性黄疸时，肠道黏膜的损伤程度比较轻微，只表现为电子显微镜下黏膜线粒体结构的改变，未见随着梗阻性黄疸时间的延长而加重;血液中内毒素含量在发生梗阻1周及2周时无明显差异.综上所述，梗阻性黄疸初期肠道内胆盐的减少、细菌的异常繁殖及肠道黏膜的缺血缺氧可造成肠源性内毒素大量进入血液，并逐渐达到高峰，但随着梗阻时间的延长，肠道黏膜的免疫屏障功能保护性增强，进入血液的内毒素量减少，且肾脏在NO作用下排除一定量的内毒素，故发生梗阻性黄疸后血液中内毒素含量的变化呈先升高后降低的趋势.

　［参 考 文 献］

    ［1］ Hutcheson IR，Whittle BJR，Boughton-Smith NK.Role  of nitric oxide in maintaining vascular integrity in endo-toxin-induced acute intestinal damage in the rat［J］.Br JPharmacl，1990，101（4）:815.

    ［2］ 毛美琴.肝病与内毒素血症［J］. 广西医学 ，1993，15（2）:112.

    ［3］ 刘金刚，那延立，郭宏斌，等.生长激素减轻梗阻性黄疸时肠菌及内毒素移位的实验研究［J］. 普外基础与临床杂志 ，2002，5（3）:172.