bcl-6基因非编码区结构多态性及蛋白表达与移行上皮癌关系研究

              作者：林贞花，韩龙哲，任香善，李柱虎，宋京郁 

【关键词】  ,,原位癌;基因表达;泌尿系肿瘤

　摘要］ ［目的］ 分析bcl-6基因5′端非编码区-1结构多态性及其蛋白在泌尿系统移行上皮癌及远端正常移行上皮组织中的表达情况. ［方法］ 收集47例膀胱、肾脏及尿道移行上皮癌以及20例远端正常移  行上皮组织蜡块，应用PCR-SSCP分析bcl-6基因5′端非编码区E1.11，E1.12区结构多态性，并应用免疫组织化学染色方法检测bcl-6蛋白表达情况. ［结果］ bcl-6基因5′端非编码区E1.12的结构多态性多见于Ⅰ级移行上皮癌中.bcl-6蛋白在正常移行上皮组织中的表达阳性率较低，且规则地分布在表层;在移行上皮癌组织中bcl-6蛋白的表达率较高，且分布不规则. ［结论］ bcl-6基因5′端非编码区E1.12区 域的结构多态性及bcl-6蛋白的过度表达可能在移行上皮癌的分化和分级过程中起重要的作用，但两者  无相关性.

    ［关键词］  原位癌;基因表达;泌尿系肿瘤

    ABSTRACT:OBJECTIVE To analyze the5′non-coding exon1of bcl-6gene and its protein expression in transitional cell carcinomas（TCCs）and normal transitional epithelial cells adjacent to the TCCs.METHODS The paraffin blocks of47transitional cell carcinomas of the urinary bladder，kidney，urethra，and20normal transitional epithelial tissues adjacent to the TCCs were investigated by polymerase chain reaction-single stranded DNA conformation polymorphism（PCR-SSCP）and immunohistochemical methods.RESULTS The positive ra-  tio of bcl-6conformation polymorphism at exon1.12in gradeⅠwas significantly higher than that in gradeⅠand gradeⅢof TCCs.Bcl-6protein had a low positive rate in normal transitional epithelium，and the positive cases showed regularly expression pattern in the upper layer of normal transitional epithelia，where-as，bcl-6protein was irregularly and heavily stained in the nucleus of the TCCs.CONCLUSION Bcl-6gene conformation polymorphism at exon1.12and the over-expression of bcl-6protein may play some roles in the differentiation and histopathologic grade of TCC，but the over-expression of bcl-6protein was not related with the bcl-6gene conformation polymorphism at5′non-coding exon1.Key words:carcinoma in situ;gene expression;urologic neoplasms

    bcl-6基因位于染色体3q27上，具有转录抑制作用.大量的研究结果表明bcl-6基因5′端非编码区突变在降低bcl-6蛋白表达过程中起重要作用.bcl-6蛋白主要表达在生发中心B细胞及其来源的肿瘤细胞中，而且对于生发中心的形成起到非常重要的作用 ［1，2］ .据报道，bcl-6蛋白也表达在正常皮肤鳞状上皮及其来源的肿瘤细胞中 ［3，4］ ，从而推断出bcl-6 蛋白亦可能在上皮组织分化过程中起非常重要的作用.2003年本实验室首次在泌尿系统肿瘤中发现了bcl-6，bcl-2蛋白的表达，同时还发现二者具有相反的表达 ［5］ .为了进一步明确bcl-6基因及其蛋白在移行上皮肿瘤发生过程中的作用，本文利用PCR-SSCP和免疫组织化学方法研究了bcl-6基因突变高发区5′端非编码区-1的结构多态性和bcl-6蛋白表达情况，并探讨了bcl-6基因在移行上皮肿瘤恶性进程中的作用.

    1 材料和方法

    1.1 材料  收集47例膀胱、肾脏及尿道移行上皮 癌组织，其中临床病理组织学分级Ⅰ级为19例，Ⅱ级为13例，Ⅲ级为15例;20例远端正常移行上皮组织来源于韩国高丽大学校医科大学安岩（Anam）病理科;行常规HE染色，选取适当蜡块和部位 提取DNA.

    1.2 方法

　 1.2.1 DNA提取及PCR-SSCP分析  应用DNA纯化试剂盒进行DNA提取，并用酶标仪进行DNA定量检测.PCR仪选用2400型PCR扩增仪，引物序列为5′-AGG AAG GAG GGG AAT TAG-3′（sense），5′-AAG CAG TTT GCA AGC GAG-3′（antisense）（E1.11）和5′-TTC TCG CTT GCA AAC TGC-3′（sense），5′-CAC GAT ACT TCA TCT CAT C-3′（antisense）（E1.12），扩增产物大小分别为215，295bp.在95℃条件下变性5min，继而进行94℃35s，55℃30s（E1.11，E1.12）和72℃45s的40个循环周期，在72℃条件下延伸5min，4℃冷却.取2μL PCR产物煮沸3min，于100V电压条件下在120g/L多聚丙烯酰胺凝胶溶液中电泳过  夜，行银染色观察分析所得条带.

    1.2.2 免疫组织化学染色  单克隆bcl-6抗体购自美国DAKO A/S公司，Denmark抗体的稀释度为1∶100，采用Elivision非生物素免疫组织化学检测方法进行，DAB显色.结果判定标准:染色后细胞核内出现棕褐色物质的细胞为阳性细胞，75%以上的细胞呈阳性时判定为强阳性（），50%～75%呈阳性时为阳性（），50%以下的细胞呈阳性时为弱阳性（+），无阳性细胞为阴性;强阳性（）及阳性（）均列入强阳性结果中.

    1.2.3 统计学处理  应用SPSS软件，采用Chi-square（χ 2 -test）方法进行.

　 2 结果

    2.1 bcl-6基因5′端非编码区-1基因结构多态性分析  bcl-6基因5′端非编码区-1结构多态性与移行上皮癌分级之间的关系见表1.由表1可见，Ⅰ级移行上皮癌中bcl-6基因非编码区E1.12区结构多态性的存在明显多于Ⅱ级和Ⅲ级移行上皮癌，且与Ⅲ级比较有显著性差异（P<0.05）.在5例同时存在E1.11，E1.12区结构多态性的病例中，3例为Ⅰ 级，Ⅱ级及Ⅲ级各为1例.bcl-6基因5′端非编码区表1 bcl-6基因5′端非编码区-1结构多态性与移行上皮癌分级之间的关系    2.2 bcl-6蛋白在正常和恶性移行上皮癌组织中的表达  在正常移行上皮组织中bcl-6蛋白规则地表达在上皮表层部位，而在恶性移行上皮癌组织中bcl-6蛋白则不规则地表达在多层移行细胞内.在47例恶性移行上皮癌组织中bcl-6蛋白表达阳性例数为29例（62%），明显高于正常组织2例.bcl-6蛋白表达与移行上皮癌临床病理组织学分级之间的关系见表2.由表2可见移行上皮癌Ⅰ级中强阳性表达例数为13例，Ⅱ级中为6例，均明显高于Ⅲ级中的2例，且均存在显著性差异（P<0.05，P<0.01）. 2.3 bcl-6基因5′端非编码区结构多态性与bcl-6蛋白过度表达的关系  bcl-6蛋白表达与5′端非编码区-1部位是否存在结构多态性间无相关性，但在 5例表现为bcl-6蛋白胞浆内阳性的移行上皮癌组织中bcl-6基因5′端非编码区-1结构均存在多态性. 表2 bcl-6蛋白的表达与移行上皮癌分级之间的关系

    3 讨论

    bcl-6蛋白是分子质量为96ku的核蛋白，它选择性地表达在正常或中度成熟的B细胞中.bcl-6基因易位和（或）非编码区突变在弥漫性大B细胞淋巴瘤在B细胞中频繁发生，且以bcl-6基因的非编码区E1.11，E1.12为突变高发区.据报道，bcl-6蛋白也表达在正常皮肤和上皮性肿瘤细胞中 ［6～8］ .本实验结果表明，bcl-6基因5′端非编码区E1.12结构多态性的发生频率随着移行上皮癌临床病理组织学分级的降低而逐渐增多，提示E1.12区域基因异常与移行上皮癌组织学分级密切相关.同时，免疫组织化学染色结果表明，bcl-6蛋白主要存在于细胞核内，在正常移行上皮中仅有2例表现为表层细胞的规则性阳性;在移行上皮癌组织中bcl-6蛋白却无地存在于各层次细胞中，且阳性率高达62%;在Ⅰ，Ⅱ级移行上皮癌组织中bcl-6蛋白表达阳性率分别为68%，46%，明显高于Ⅲ级移行上皮癌中.上述染色结果与［3，4］的在鳞状上皮及其肿瘤中的研究结果相似，从而设想bcl-6蛋白在移行上皮的分化过程中可能起非常重要的作用.研究中还发现，bcl-6蛋白在移行上皮癌中的过度表达与5′端非编码区-1部位的结构变异无关联，但在47例移行上皮癌中表现为胞浆内强阳性的5例标本，均存在bcl-6基因非编码区-1部位的结构多态性，因此认为此区域基因的突变或缺失等基因改变可能参与蛋白异常表达过程，但尚待于进一步研究证实.总之，bcl-6基因改变及其蛋白过度表达在泌尿系统恶性肿瘤组织学分级和分化过程中起重要的作用.

　［参 考 文 献］

    ［1］ Toshiko O，Masatsugu M，Tadanori Y，et al..Bcl gene product，a92-to98-kD nuclear phosphoprotein，is highly expressed in germinal center B cells and their neoplastic counterparts［J］.Blood，1995，86（1）:28.

    ［2］ Vicki LS，David A，Yunsheng H，et al..Transcriptional  repression by the proto-oncogene bcl-6［J］.Oncogene， 1996，12（2）:331.

    ［3］ Takehiko Y，Tetsuya F，Shinichiro O，et al..The bcl-6 gene is predominantly expressed in keratinocytes at their terminal differentiation stage［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，228:216.

    ［4］ Nobuo K，Masatsugu M，Toshiko O，et al..Expressionof bcl-6protein in normal skin and epidermal neoplasms ［J］.Pathol Int，1997，47:600.

    ［5］ Lin Z，Kim H，Park H，et al..The expression of bcl-2 and bcl-6protein in normal and malignant transitional epithelium［J］.Urol Res，2003，31:272.

    ［6］ King BE，Chen C，Locker J，et al..Immunophenotypicand genotypic markers of follicular center cell neoplsia in diffuse large B-cell lymphomas［J］.Modern Pathol，2000，13（11）:1219.

    ［7］ Albagli O，Dhordain P，Deweindt C，et al..The BTB/ POZ domain:a new protein/protein interaction motif common to DNA and actin-binding protein［J］.Cell Growth Differ，1996，6:1193.

    ［8］ Tohru M，Norihiko K，Shinsaku H，et al..Geneinvolved in the3q27translocation associated with B-cell lymphoma，bcl-5，encodes a Kruppel-like Zinc-finger protein［J］.Blood，1994，83（1）:26.