沙棘汁对铅所致小鼠脑组织生物化学指标的影响

             作者：许妍姬，韩春姬，李莲姬    

【关键词】  脂质过氧化作用;生物源单胺类;胆碱酯酶类;植物,药用;小鼠

       ［摘要］ ［目的］ 研究沙棘汁对醋酸铅所致小鼠脑脂质过氧化及胆碱酯酶和单胺类神经递质含量改变的影响. ［方法］ 制作铅中毒小鼠模型，灌胃给予不同剂量的沙棘汁，利用硫代巴比妥酸比色法、碱性羟胺法及荧光法分别测定小鼠脑组织内过氧化脂质、胆碱酯酶及单胺类神经递质含量. ［结果］ 铅组小鼠脑组织内MDA含量明显升高，200，400g/L沙棘汁降低铅致MDA含量升高，且呈剂量-效应关系;铅组小鼠脑组织内胆碱酯酶活性明显升高，单胺类神经递质中除DA外NE，5-HT，5-HIAA含量均明显下降，400g/L沙棘汁抑制铅致脑组织内多种神经递质含量的变化. ［结论］ 沙棘汁可拮抗铅所致小鼠脑组织内脂质过氧化及胆碱酯酶和单胺类神经递质含量的改变.

    ［关键词］  脂质过氧化作用;生物源单胺类;胆碱酯酶类;植物，药用;小鼠

       Effects of the Hippophae Rhamnoides L juice on lead-induced change of lipid peroxidation，acetylcholinesterase and catecholamine neurotrans-mitters in mice brain

       ABSTRACT:OBJECTIVE To study the effects of the Hippophae Rhamnoides L juice on lead-induced change of lipid peroxidation，acetylcholinesterase（AchE）and catecholamine neurotransmitters in mice brain.METHODS Mice were administrated peritoneal injection with lead acetate，then mice were given various dosages of Hippophae Rhamnoides L juice by gavage.The value of MDA was determined by the thiobarituric acid colorimetricmethod，and the activity of AchE was determined by the alkaline hydroxylamine method，and contents of NE，DA，5-HT were determined by the flourimetric method.RESULTS The MDA levels were increased in lead-treated mice，which were reduced by200，400g/L Hippophae Rhamnoides L in dose-dependent manner.The activities of AchE was significantly increased in the lead-treated group，which were decreased by400g/L Hippophae Rhamnoides L.The levels of NE，5-HT，5-HIAA were significantly decreased in the lead-treated mice，and this decreases were antagonized by400g/L Hippophae Rhamnoides L，except for that in dopamine.CONCLUSION Hippophae Rhamnoides L juice has protective effects against the lead acetate-induced changes in neurobiochemical parameters.

    Key words:lipid peroxidation;biogenic monoamines;cholinesterases;plants，medicinal;mice

    铅是广泛存在于环境中的强神经毒物，可影响神经系统的许多功能.动物实验及临床观察结果表明，铅中毒可引起行为和智力障碍，可改变一些酶的活性，减少突触前神经递质的释放，影响自由基代谢 ［1，2］ .沙棘为胡颓子科酸刺属灌木，含有多种维生素（E，C，B 1 ，B 2 ，B 6 ）、氨基酸、黄酮、脂肪油及微量元素等物质，具有降血脂、抗心律失常、抗氧化、抗癌、抗过敏及增强免疫功能等功效 ［3］ .本实验选用神经生物化学实验方法，观察了沙棘对铅致小鼠脑脂质过氧化及胆碱酯酶和单胺类神经递质含量改变的影响.

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 试剂  沙棘汁为采集于吉林省珲春市郊产沙棘果经压榨及过滤而得原汁，加水配制成200，400g/L;醋酸铅为哈尔滨市化工试剂厂产品，临用前用双蒸水配制成浓度为10mmol/L的溶液，以每g体重10μL的剂量行腹腔注射;NE，DA，5-HT，5-HIAA购自Sigma公司;MDA测试盒、胆碱酯酶测试盒、蛋白质定量试剂盒购自南京建成生物工程公司.

    1.1.2 实验动物  取昆明种小鼠，体重为20～22g，雌雄兼用，由延边大学医学部实验动物科提供.

    1.2 方法

    1.2.1 过氧化脂质含量的测定  取昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组各为10只.1）对照组:每日腹腔注射等体积生理盐水10mL/kg;2）铅组:每日腹腔注射醋酸铅溶液10mg/kg;3）400g/L沙棘汁组:每日灌胃给予400g/L沙棘汁10mL/kg;4）铅加200g/L沙棘汁组:上午灌胃给予200g/L沙棘汁10mL/kg，下午腹腔注射醋酸铅溶液10mL/kg;5）铅加400g/L沙棘汁组:上午灌胃给予 400g/L沙棘汁10mL/kg，下午腹腔注射醋酸铅溶液10mL/kg.连续给药20d，其后对相应组别小鼠隔日分别给予200及400g/L沙棘汁灌胃，给予对照组小鼠等量生理盐水灌胃，共5次.实验第31日处死动物，取脑，称其质量，在预冷的0.32mol/L蔗糖，10mmol/L PBS（pH值为7.4）中以1∶10的比例匀浆，以3500r/min离心10min，取上清液，用MDA测试盒测定过氧化脂质含量.

    1.2.2 胆碱酯酶活性的测定  分组、染毒方式及给药方法同1.2.1项下方法.实验第31日处死动物，取脑，称其质量，在70mmol/L PBS中匀浆，离心30min，取上清液50μL置于反应管内，利用胆碱酯酶测试盒测定胆碱酯酶活性 ［4］ .

    1.2.3 神经递质含量的测定  分组、染毒方式及给药方法同1.2.1项下方法.实验第31日，处死动物，取脑，称其质量，在冰浴条件下与冷酸化正丁醇以1∶10的比例匀浆，补足液体至4mL，旋涡振荡5min，以3000r/min离心5min，取上清液2.5mL置于反应管内，加入正庚烷5.0mL，0.1mol/L盐酸5.0mL，旋涡振荡5min，以3000r/min离心5min，其水相内含有5-HT，NE，DA，有机相内含有5-HIAA  ［4，5］ .NE，DA含量的测定:取水相0.5mL，加70mmol/L PBS1.7mL（pH值为7.2），碘试剂0.1mL，静置2min，加碱性亚硫酸钠溶液0.5mL，静置2min，加入6mol/L HAc溶液0.6mL，煮沸20min，冷水冷却，用荧光分光光度计在475/385nm处测定NE的荧光强度，在370/322nm处测定DA的荧光强度.5-HT含量的测定:取水相0.5mL，加入5g/L半胱氨酸0.1mL，40mg/L邻苯二甲醛3mL，煮沸10min，冷水冷却，用荧光分光光度计在475/350nm处测定5-HT的荧光强度.5-HIAA含量的测定:取有机相0.5mL，加入0.5mol/L PBS1.5mL（pH值为7.0），旋涡振荡10min，以3000r/min离心5min，取水相（含5-HIAA）1mL置于反应管内，加入10g/L半胱氨酸0.1mL，1g/L邻苯二甲醛0.1mL，20mg/L NaIO 4 溶液0.1mL，煮沸5min，冷水冷却，用荧光分光光度计在475/350nm处测定5-HIAA的荧光强度.

    1.2.4 统计学处理  所有数据均用SPSS统计软件进行单因素方差分析.

    2 结果

    2.1 沙棘汁对铅中毒小鼠脑过氧化脂质含量的影响  铅组小鼠脑过氧化脂质的含量明显高于其他各组，与对照组比较有显著性差异（P<0.05）;铅加200g/L沙棘汁组和铅加400g/L沙棘汁组小鼠脑MDA含量明显低于铅组，且具有剂量-效应关系，与铅组比较均有显著性差异（P<0.05，P<0.01）0;400g/L沙棘汁组小鼠脑过氧化脂质含量低于对照

    2.2 沙棘汁对铅中毒小鼠脑胆碱酯酶活性的影响  铅组小鼠脑组织胆碱酯酶活性明显高于其他各组，与对照组比较有显著性差异（P<0.05）;铅加400g/L沙棘汁组小鼠脑组织胆碱酯酶活性明显降低，与铅组比较有显著性差异（P<0.05）;铅加200g/L沙棘汁组小鼠脑组织胆碱酯酶活性与铅组比较无显著性差异（P>0.05）;见Fig2.

    2.3 沙棘汁对铅中毒小鼠脑组织单胺类神经递质含量的影响  铅组小鼠脑组织内NE，5-HT，5-HIAA含量均低于对照组，分别与对照组比较均有显著性差异（P<0.05），但DA含量虽低于对照组，但无显著性差异（P>0.05）;400g/L沙棘汁可缓解铅致脑组织5-HT，5-HIAA含量下降，但不能拮抗NE，DA含量变化;200g/L沙棘汁不能拮抗铅致脑组织单胺类神经递质含量的变化;单独给予400g/L沙棘汁可增加脑组织5-HT含量;见

　3 讨论

    脂质过氧化作用可导致细胞功能与结构的改变，而神经系统内含有丰富的脂质，故脂质过氧化对神经细胞的损伤尤为明显.染铅后细胞的脂质过氧化作用增强，以抗氧化物SOD，CAT，GSH-Px为标志的神经元抗氧化能力下降，据此推断铅是通过对神经细胞的氧化损伤来发挥其神经毒作用的 ［6］ .本实验结果表明，铅组小鼠脑组织MDA含量明显高于对照组，与报道相符.沙棘果汁内含有可清除氧离子的SOD ［3］ ，可明显增强正常小鼠GSH-Px活性，降低过氧化脂质含量 ［7］ .本实验结果表明，400g/L沙棘汁可拮抗铅致小鼠脑组织MDA含量的升高，可能与上述沙棘抗氧化机制有关.阮迪云 ［7］ 报道，胆碱类递质参与学习记忆过程.在体和离体实验均证实铅可诱发乙酰胆碱释放的减少和胆碱能系统功能降低，而铅可引起M 2 受体激动剂的超敏感性，从而激活M 2 受体，最终使乙酰胆碱释放量减少.本实验中给予10mg/kg醋酸铅的小鼠脑组织胆碱酯酶活性增强，与文献报道有所差异，可能与测定部位、方法及染毒剂量不同有关.Pillai等 ［8］ 报道，50μg/kg铅染毒15d可导致雌性大鼠下丘脑组织DA，NE，5-HT含量下降.本研究结果示，10mg/kg铅染毒20d时小鼠脑组织DA，NE，5-HT含量明显下降，与文献报道相符.沙棘中的维生素C含量是 许多果实及蔬菜之冠 ［3］ ，Goyer等的动物实验认为 维生素C排除组织内的铅的能力较EDTA好，沙棘还含有维生素B 1 ，B 2 ，B 6 等 ［3］ ，而维生素B 1 可加速 铅排泄 ［9］ ，故沙棘汁具有降低铅在体内的吸收和蓄积的作用.本实验结果进一步在生物化学机理上证实了沙棘汁具有保护铅致小鼠脑组织损伤的作用，关于沙棘是否具有排铅作用尚待进一步研究阐明.

　［参 考 文 献］

    ［1］ 时胜利，陈自强.铅染毒对大鼠神经行为功能及神经化学的影响［J］. 中华预防医学杂志， 1995，3（2）:80.

    ［2］ 陆巍.铅的神经毒作用机制［J］. 国外医学卫生学分册 ，1995，22（6）:341.

    ［3］ 李巧如.沙棘研究进展［J］. 中医药信息杂志 ，1996，3（3）:10.

    ［4］ 何美霞，可君.脑组织中单胺类神经递质含量测定［J］.河南医科大学学报 ，1996，31（1）:113.

    ［5］ 吴旭增，刘静雯.用荧光法测定大鼠脑单胺类神经递质 的条件探讨［J］. 中国药通报 ，1987，3（6）:371.

    ［6］ 王荫棠.四种中草药对荷瘤小鼠抗氧化作用的实验观  察［J］. 兰州医学院学报 ，1991，17（4）:183.

    ［7］ 阮迪云.铅影响学习记忆的细胞和分子机制［J］. 卫生毒理学杂志 ，1996，10（3）:153.

    ［8］ Pillai A，Priya L，Gupta S.Effect of combined exposure to lead and cadmium on the hypothalamic-pituitary axis function in prostrous rats［J］.Food and Chemical Toxi-cology，2003，41:379.

    ［9］ 刘永泉.驱铅辅助药物的研究进展［J］. 国外医学卫生学分册 ，1997，24（1）:10.