牛磺酸对氯化镉诱导大鼠DNA损伤的保护作用
［关键词］ DNA损伤;牛磺酸;镉;单细胞凝胶电泳;大鼠
Protective effects of the taurine on DNA damage of whole hemocytes induced by cadmium chloride in rats
ABSTRACT:OBJECTIVE To study suppressing effects of the taurine on the DNA damage of whole hemocytes induced by cadmium chloride in vitro.METHODS The tests were divided into five guoups:control group，Cd groups，co-treatment groups，post-treatment groups and pre-treatment groups.The single cell gel electrophoresis assay was used to inspect the DNA damage of whole hemocytes in rats.RESULTS Various doses of cadmium chloride could induce the increasing of the rate of DNA damage of whole hemocytes，but when the taurine in advance was given，the rate of DNA damage of whole hemocytes was significantly decreased in each groups.CONCLUSION The taurine can suppress the DNA damage induced by CdCl 2 in rats.Key words:DNA damage;taurine;cadmium;SCGE;rats
牛磺酸的化学名称为2-氨基乙磺酸，是一种β硫氨基酸，作为牛胆汁的组成成分于1827年首次从动物组织中分离出来 ［1］ ，它在调节机体正常生理功能、增强细胞膜抗氧化作用及抗自由基等方面具有广泛的生物学效应.镉具有遗传毒性，1994年被国际癌症研究会（IARC）列为Ⅰ级致癌物，即人类致癌物.镉的致癌作用与它损伤DNA和影响DNA修复有关 ［2］ .本研究应用单细胞凝胶电泳技术观察了牛磺酸对氯化镉所致大鼠DNA损伤的保护作用.
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物取体重为220～280g的Wistar大鼠，由延边大学医学部实验动物科提供.试剂:牛磺酸为上海新兴化工试剂研究所产品，批号为990308;氯化镉（分析纯）为天津市化学试剂二厂产品;正常熔点琼脂糖（分析纯）为Promega公司产品;低熔点琼脂糖（分析纯）为Sigma公司产品;溴化乙锭为Fluka公司产品;其他试剂均为国产分析纯.仪器:Olympus荧光显微镜为日本产.
1.2 方法
1.2.1 全血细胞培养及分组 完全培养基含RPMI1640，100g/L胎牛血清，60mg/L青霉素，1mg/L链霉素，植物血凝素（PHA）.给Wistar大鼠行乙醚麻醉，眼球取12mL血，肝素抗凝.所有剂量均设2个平行样本，向每个培养瓶加入3mL完全培养基，0.4mL全血;1）阴性对照组:加入0.2mL生理盐水;2）氯化镉组:加入0.1mL生理盐水和0.1mL氯化镉溶液，使终浓度分别达到10，20，40μmol/L;3）同时处理组:同时加入0.1mL100mmol/L牛磺酸和分别为10，20，40μmol/L的氯化镉;4）后处理组:预先分别加入0.1mL10，20，40μmol/L氯化镉，培养45min后加入0.1mL100mmol/L牛磺酸;5）预先处理组:预先加入0.1mL100mmol/L牛磺酸，培养45min后分别加入0.1mL10，20，40μmol/L氯化镉.各组混匀后置于37℃，恒温箱内培养72h;培养终止前每个培养瓶中加入15μg/L秋水仙素，混匀后在37℃恒温箱内继续培养4～6h.
1.2.2 单细胞凝胶电泳 实验步骤参照Singh等 ［3］ 的方法加以改进.取磨砂载玻片，第一层铺10g/L正常熔点琼脂糖100μL，立即加盖玻片，4℃凝固5min，取出，小心取下盖玻片，铺第二层含待测细胞的低熔点琼脂糖75μL，立即加盖玻片，4℃凝固10min，取出，取下盖玻片，在第二层胶上再铺一层7.5g/L低熔点琼脂糖70μL，加盖玻片，4℃凝固10min，取出，取下盖玻片.将制好的胶片浸泡于新配制的冷裂解液中.裂解液:氯化钠2.5mol/L，Na 2 -EDTA100mmol/L，Tris10mmol/L，肌氨酸钠10g/L，调节pH值至10.0，加蒸馏水定容至500mL，临用前加入Triton X-10010g/L，4℃下备
用，4℃裂解1h.取出胶板，置入电泳槽，内含氢氧 化钠300mmol/L，Na 2 -EDTA1mmol/L，加蒸馏水1000mL，解旋20min，4℃电泳20min.电泳后取出胶板，用中和液（0.4mol/L Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5）浸泡2次，每次为10min.取出胶板，滴加5mg/L溴化乙锭染色20min，蒸馏水脱色15min.在荧光显微镜下观察荧光细胞数.每个样本计数60个细胞，出DNA损伤百分率.
1.2.3 统计学处理 数据采用SPSS10.0软件进行方差分析.
2 结果
各组细胞的DNA损伤率:由表1可见，氯化镉组大鼠全血细胞DNA损伤率明显高于阴性对照组（P<0.05）;给予相应浓度牛磺酸处理的预先处理组及同时处理组的DNA损伤率均明显低于氯化镉组（P<0.05），且预先处理组优于同时处理组;后处理组与相应的氯化镉组比较无显著性差异（P>0.05）.表1 牛磺酸对大鼠全血DNA损伤率的影响
3 讨论
由金属诱导的DNA损伤包括DNA单链或双链断裂、DNA-DNA交链、DNA-蛋白交联及碱基修饰等.本实验通过单细胞凝胶电泳检测到的DNA损伤主要是DNA单链断裂.镉诱发的DNA损伤与镉引起的氧化应激反应有关 ［4］ ，而镉不仅诱发DNA损伤，还可明显抑制DNA修复 ［5］ ，但其机制尚不明确.本实验结果表明，不同剂量的氯化镉均可引起DNA损伤，并可见低剂量镉（10μmol/L）即可诱发DNA损伤，且呈一定的剂量-效应关系，而后处理组的DNA损伤率与氯化镉组相比较无明显差异.Banfalvi等 ［6］ 研究了镉对DNA修复和DNA复制的影响，发现它可引起DNA单链断裂及8-羟基脱氧鸟苷的生成，诱发DNA损伤并抑制DNA修复.牛磺酸与M 2+ 有较高的亲和性，具有广泛的生物效应.本实验结果表明，牛磺酸对镉引起的DNA损伤有一定的保护作用，其机制可能为它与镉离子结合，减少与DNA修复酶的结合及钙离子内流，降低细胞内钙离子浓度，抑制钙离子依赖的内源性核酸内切酶活性，减少DNA断裂;与镉离子结合形成较为稳定的络合物，减少钙离子内流及降低对锌离子的置换作用，提高DNA修复及对抗损伤能力 ［7］ .总之，牛磺酸对氯化镉诱导的大鼠DNA损伤具有拮 抗作用.
［参 考 文 献］
［1］ Sturman JA.Taurine in development［J］.PhysiologicalReviews，1993，739（1）:119.
［2］ International Agency For Research on Cancer（IARC）. Cadmium and cadmium compounds［J］.IARC Mono- gragfs，1994，58:119.
［3］ Singh NP，Mccoy MT，Tice RR，et al..Asimple tech- nique for quantiation of low level of DNA damage in indi- vidual cells［J］.Exp Cell Res，1988，175（1）:184.
［4］ Bagchi D，Joshi SS，Baghi M，et al..Cadmium-and chrimium-induced oxidative stress，DNA damage，and apoptotic cell death in cultured human chronic myeloge-nous leukemic K562cells，promyelocytic luekemic HL-60cells，and normal peripheral blood mononuclear cells［J］.Biochem Mol Toxicol，2000，14:33.
［5］ Potts RJ，Bespalov IA，Wallace SS，et al..Inhibition ofoxidative DNA repair in cadmium-adapted alveolar ep-ithelial cells and the potential involvement of metalloth- ionein［J］.Toxicology，2001，161（1-2）:25.
［6］ Banfalvi G，Littlefield N，Hass B，et al..Effect of cad- mium on the relationship between replicative and repair DNA synthesis in synchronized CHO cells［J］.Eur J Biochem，2000，267（22）:6580.
［7］ 叶萌，韩春姬.牛磺酸对氯化镉染毒小鼠的保护作［J］. 环境与职业医学， 2003，20（5）:360
