半重叠式多重引物PCR和基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中的应用

              作者：金贵善 ，全成旭 ，刘福生 ，柴奇  

【摘要】  ［目的］ 探讨半重叠式多重荧光多重引物PCR和基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中的应用. ［方法］ 从普通石蜡切片组织标本中提取基因组DNA，用半重叠式多重荧光多重引物PCR扩增，利用DNA测序仪对其产物进行基因扫描分析. ［结果］ 37例T细胞淋巴瘤中27例检测出有克隆性重排;25例B细胞淋巴瘤中2例呈阳性;10例何杰金氏淋巴瘤和7例反应性增生病例均呈阴性. ［结论］ 在T细胞受体γ基因重排克隆性检测中，半重叠式多重荧光多重引物PCR及基因扫描技术具有样本来源便利，灵敏度高，特异性强，耗时短等优点，可作为T细胞淋巴瘤的诊断及鉴别诊断的辅助检测手段.

【关键词】  聚合酶链反应;淋巴瘤，T细胞;受体，抗原，T细胞，γ-δ;基因重排，T淋巴细胞

    免疫球蛋白基因和T细胞受体（TCR）基因克隆性重排已成为诊断淋巴系统恶性肿瘤常用的基因 标志，而TCR基因重排检测可辅助诊断T细胞淋巴瘤.由于TCR的γ基因重排可出现在几乎所有的T淋巴细胞及T淋巴细胞瘤，且结构相对简单，故常用于T细胞的克隆性检测 ［1］ .Southern杂交和聚合酶链式反应（PCR）均为重要的克隆性检测手段，其中Southern杂交法虽敏感且有特异性，但由于存在操作繁杂、耗时长及需使用新鲜组织等缺点，故广泛应用被受到限制.本实验采用可覆盖所有TCR-γ链可变区（Vγ）和连接链（Jγ）的多重通用引物，经过半重叠式PCR扩增及基因扫描，给经HE形态学、免疫组织化学和Southern杂交法确诊的淋巴瘤患者石蜡包埋组织标本的TCR-γ基因重排进行了检测，探讨了它在T细胞淋巴瘤诊断中的应用价值.

    1 材料与方法

    1.1 标本来源及病理分类  79例病理石蜡组织标本取自北京市神经外科研究所病理室，按照WHO1999年标准进行病理分类，其中T细胞淋巴瘤为37例，B细胞淋巴瘤为25例，何杰金氏淋巴瘤为10 例，淋巴组织反应性增生为7例.

    1.2 DNA的提取  常规方法提取石蜡标本中的组织DNA，制作4～10μm厚的普通石蜡切片标本，常规脱蜡处理，对照HE染色标本，将适量大小的肿瘤组织用刀片刮下，放入20～50μL裂解液中（10mmol TE buffer，1mmol EDTA），同时加入蛋白酶K使终浓度达到200mg/L，56℃恒温水浴孵育过夜，经94℃，10min灭活处理后，以12000r/min离心2min，上清液用作PCR模板.在重排测定前给所有模板进行β球蛋白的PCR扩增，呈阳性者用于重排检测，阴性者用前述方法重新提取.

    1.3 引物选择  采用半巢式多重引物PCR方法对TCR-γ基因的重排进行检测.PCR所采用的通用引物包括覆盖所有可变区家族（V γ Ⅰ～V γ Ⅳ）的4个正向引物和连接链（J γ ）的4个反向引物，引物序列见Table1.第2轮PCR中用V γ Ⅰ/B代替第1轮中的V γ Ⅰ/A，同时在4个正向引物的5′端均标记荧光染料，其中V γ Ⅰ，V γ Ⅳ标记同颜色荧光.用此多重引物扩增V γ Ⅰ～V γ Ⅳ的预期片段大小分别为260，180，160，150bp.因V γ Ⅰ与V γ Ⅳ的片段相差110bp，故虽为同颜色荧光，但并不影响相互区分.

　　1.4 半重叠式多重荧光多重引物PCR  向25μL反应体系中加入模板DNA、多重引物、Ampli Taq Gold聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液.PCR反应条 件:94℃变性5min，扩增温度94℃30s，65℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸7min.第2轮PCR中取1μL第1轮PCR的产物为模板，同时用荧光染料标记的正向引物替代第1轮中的相应引物.取5μL PCR产物在20g/L琼脂糖凝胶中电泳，同时加入PhiX174DNA分子质量标准，对PCR产物进行初步鉴定.

    1.5 PCR产物序列测定  为验证本实验中所采用的半巢式多重引物PCR反应的有效性和准确性，取4例经Southern Blot证实有单克隆γ受体重排，并且经多重引物PCR后，其产物在琼脂糖凝胶电泳中片段大小有明显差异的T细胞淋巴瘤DNA样本（Fig1中Lane1，9，11，2的样本），进行基因扫描和基因序列测定.样本的准备:以基因组DNA为模板，用未作荧光标记的多重引物经半重叠式PCR后，取2.5μL PCR产物加入1μL ExoSAP（Amer-sham Biosciences），37℃孵育30min，去除多余的dNTPs和引物，再经80℃，20min灭活处理，用未做标记的正向引物进行DNA序列测定.

    1.6 基因扫描  给用荧光引物扩增的PCR产物进行基因扫描，上样总量为5μL，其中含有0.5μL PCR产物、0.5μL碱基长度标准参照物（Genescan-500ROX，PE/Applied Biosystems）、2μL甲酰胺及0.5μL上样缓冲液.样本经95℃，2min变性处理后迅速置于冰块中冷却，上样至ABI DNA序列测定仪.PCR产物经分离胶分离后，用GENESCANTM672（ABI373A，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany）扫描分析软件进行分析.

    2 结果

    2.1 琼脂糖凝胶电泳  组织标本基因组DNA首先经β-球蛋白引物扩增，证实所提取的DNA样本可用于下游实验时，再用TCR-γ的多重引物进行半重叠式PCR，扩增产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳作初步鉴定，结果见Fig1.

    2.2 DNA序列分析  4例T细胞淋巴瘤样本的PCR产物片段经基因扫描结果分别显示绿色、蓝色、黄色和淡黄色的尖锐单峰，大小分别为258，182，162，150bp，根据颜色和bp大小判断应分别为V γ Ⅰ，V γ Ⅱ，V γ Ⅲ，V γ Ⅳ可变区的重排.经序列测定，并与基因库中T细胞γ受体基因序列（序列号为NG001336）进行比对，证实分别为V γ 2～J γ 2，V γ 9～J γ 2，V γ 10～J γ 2和V γ 11～J γ p1区间序列，与基因扫描结果一致.此结果囊括了4种可变区的序列，提示本项实验中所用多重引物可靠.

    2.3 基因扫描  选择琼脂糖凝胶电泳中阳性结果的样本，进行基因扫描分析.扫描图中，狭窄的锐利单峰表示有克隆性重排;2个锐利的峰表示有2个等位基因的重排;多克隆重排显示为非特异性的宽峰;见Fig2.扫描图中黑色代表黄色荧光，红色峰为内参碱基长度标准Genescan-500ROX.37例T细胞淋巴瘤中27例检测出有γ受体的克隆性重排;25

    例B细胞淋巴瘤中2例检测出有TCR-γ受体的克 隆性重排;10例何杰金氏淋巴瘤中和7例反应性增生病例标本中均未检出有TCR-γ受体的克隆性重排;见Table2.此结果与本室常规用Southern杂交方法检测的结果基本一致.

　　3 讨论

    以PCR技术为基础的克隆性检测已成为淋巴瘤诊断的重要辅助诊断手段.正常人或反应性增生症等疾病病人淋巴细胞起源于多个克隆，基因重排方式多样，故PCR扩增产物片段长短不一，电泳后成弥散状，而肿瘤细胞为单克隆细胞，具有同一形式的基因重排，PCR产物经电泳后呈特异性条带.T细胞受体γ基因的重排发生在T细胞分化的早期，2种不同表型的T淋巴细胞（αβ和γδ）都存在着TCR-γ基因的重排，同时由于参与TCR-γ重排的基因片段数目少，故检测相对容易，被广泛应用于T细胞的克隆性检测.但是，由于TCR-γ受体重排时连接方式的有限性，导致TCR-γ不同克隆之间基因扩增产物的长度差别很小，有时仅在1个或数个碱基之间，普通的琼脂糖凝胶电泳很难将其区分开，容易造成假阳性.本研究中所采用的Gene-Scan分析方法具有高分辨能力，可检测出即使1个碱基差异的基因扩增产物，可有效地避免假阳性结果的出现，与传统的SSCP方法相比具有明显优势 ［2］ .同时，由于采用了荧光标记引物，可更直观地判断重排发生所在可变区域，可用于疾病的追踪性研究.以往的许多研究多以V γ ⅠJ为引物进行TCR-γ基因片段的扩增，但由于少数T细胞淋巴瘤的重排是由V γ Ⅰ-J 1/2 以外的基因片段参与的重排 ［3］ ，多重引物PCR方法可有效地避免由于引物设计缺陷造成的假阴性 ［4］ .本研究所设计的引物PCR产物片段最大的在260bp左右，因此即使是普通的组织石蜡切片标本也完全可以成为其DNA样品来源.本研究中，27例有TCR-γ基因重排的T细胞淋巴瘤样本中12例检测出有V γ Ⅱ～V γ Ⅳ区的重排，其中6例与V γ Ⅰ区的重排并存，另外6例为单独的V γ Ⅱ/V γ Ⅲ/V γ Ⅳ区的重排，在与V γ Ⅰ区重排并存的6例样本中，2例被证实为寡克隆.提示单纯应用V γ Ⅰ区引物扩增TCR-γ片段不仅降低检出率，造成假阴性，

    而且使部分寡克隆的样本被误认为是单克隆的重 排.上述2例寡克隆样本通过其他检查证实为T细胞淋巴瘤，寡克隆发生可能与肿瘤组织中炎性细胞浸润或肿瘤的进程相关 ［5，6］ .用半重叠式多重引物PCR-基因扫描分析技术对石蜡包埋组织标本进行检测的结果与我室常规Southern杂交检测结果基本一致，提示此方法不仅与Southern杂交检测一样具有高度灵敏性和特异性，而且由于适用于石蜡标本，故不仅可作为临床辅助诊断的检测手段，还可用于回顾性研究.经免疫组织化学及Southern杂交检测证实为B细胞淋巴瘤的病例中2例检测出TCR-γ基因重排，可能为异型基因重排，即B淋巴细胞恶性肿瘤中存在TCR-γ克隆性基因重排 ［7］ ，可能是由恶性淋巴细胞在分化过程中出现错误的双重排及分化幼稚的肿瘤细胞基因重排调控失常所致.因此认为TCR-γ基因重排并非克隆性T细胞增生所特有，还应结合其他检查进行综合判断.总之，半重叠式多重引物PCR和基因扫描技术具有病理材料来源便利，检出率高，操作简便等优点，可作为T细胞淋巴瘤的诊断及鉴别诊断的辅助检测手段.

【】
  ［1］ Khalil SH，Hamadah IR.The applicability of T-cell re-ceptor gamma gene rearrangement as an adjuvant diag-nostic tool in skin biopsies for cutaneous T-cell lymphoma ［J］.Saudi Med J，2006，27（7）:951.

［2］ Wickham CL，Lynas C，Ellard S.Detection of clonal Tcell populations by high resolution PCR using fluorescent-ly labeled nucleotides;evaluation using conventional LIS-SSCP［J］.J Clin Pathol:Mol Pathol，2000，53（3）:150.

　　［3］ Lawnicki LC，Rubocki RJ，Chan WC，et al..The dis- tribution of gene segments in T-cell receptor gamma gene rearrangements demonstrates the need for multiple primer sets［J］.J Mol Diagn，2003，5（2）:82.

［4］ van Dongen JJ，Langerak AW，Bruggemann M，et al.. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations:re-port of the BIOMED-2Concerted Action BMH4-CT98- 3963［J］.Leukemia，2003，17:2257.

［5］ Smith JL，Hodges E，Quin CT，et al..Frequent T and B cell oligoclones in histologically and immunopheno-typically characterized angioimmunoblastic lym- phadenopathy［J］.Am J Pathol，2000，156:661.

［6］ Yamauchi A，Tomita Y，Miwa H，et al..Clonal evolu- tion of gastric lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue type［J］.Mod Pathol，2001，14:957.

［7］ Hodges E，Krishna MT，Pickard C，et al..Diagnostic role of tests for T cell receptor（TCR）gene［J］.J Clin Pathol，2003，56（1）:1.