解脲脲原体及其生物群与泌尿生殖道疾病间的关系

                   作者：吴鹏 孙竞 朱名安， 李蓓

  [摘  要]  目的：探究解脲脲原体及其不同的生物群与各类泌尿生殖道疾病间的关系。方法：通过液体培养法对260份泌尿生殖道标本中解脲脲原体感染的情况进行检测，并针对其多条带蛋白基因设计引物，通过聚合酶链反应将检测到的解脲脲原体进行分群。结果：宫颈炎和习惯性流产、早产患者中解脲脲原体的分离阳性率明显高于正常对照组（P<0.01）；但不孕症组差异无显著性（P>0.05）。通过分群研究发现，在正常人和不孕症患者中主要以生物群1型感染为主，而宫颈炎患者与习惯性流产、早产患者中分离株主要为生物群2型。结论：解脲脲原体是宫颈炎和习惯性流产、早产的重要致病因素，其生物群2型与这两类疾病的发生密切相关。

    [关键词]  解脲脲原体；泌尿生殖道；生物群

    Abstract: Objective To study the relationship of genitourinary tract diseases with ureaplasma urealyticum and its biovars. Methods The distribution of U. urealyticum in 260 secretions samples of genitourinary tract through the culture in selective medium was analyzed and the isolated strains was categorized into two biovars by polymerase chain reaction (PCR) assay targeting the gene of the multi-band protein. Results The isolation rates of U. urealyticum in the patients with gential tract inflammation and habitual abortion were significantly higher than that in the healthy subjects (P<0.01). But the difference of U. urealyticum in the infertility group was not significant (P>0.05). According to the results of PCR, biovar 1 were the main biovar in the common control and infertility group and the patients of gential tract inflammation and habitual abortion were mainly infected with biovar 2.  Conclusion U. urealyticum is an important factor in the formation of gential tract inflammation and habitual abortion, and there is a distinct correlation between biovar 2 and these two kinds of diseases.

    Key words: Ureaplasma urealyticum； Genitourinary tract； Biovar

    解脲脲原体（Ureaplasma  urealyticum，Uu）是成人尤其是性成熟妇女泌尿生殖道常见的正常微生物之一，也是泌尿生殖道感染的重要病因。从表型和基因型上可将解脲脲原体分为2个生物群：微小脲原体（Ureaplasma Parvum，即传统意义上的解脲脲原体生物群1，包括血清型1，3，6，14）和解脲脲原体（Ureaplasma Urealyticum, 解脲脲原体生物群2，包括另外10个血清型）。不论是生物群1还是2均能寄居在人泌尿生殖道, 并且不同的生物群和血清型可能与不孕症、流产、死胎、女性生殖道炎症等威胁女性健康的疾病有着密切关系[1-2]。为了使临床医生能够更准确地对检测结果做出判断，区别正常携带与疾病感染状态，以便及时、有效地，本文通过液体培养法对158份临床分离和102份正常无症状者的泌尿生殖道标本中感染解脲脲原体的情况进行检测，并根据不同生物群间多条带蛋白基因的差别进行分群[3-4]，从而探究解脲脲原体及其不同生物群与宫颈炎和习惯性流产、早产等疾病间的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  标本来源: 2004年1月至2005年11月郧阳医学院附属太和妇产科、皮肤科送检的泌尿生殖道标本共158份，其中不孕症患者28人，习惯性流产、早产患者38人，宫颈炎患者92人。同时随机选择102名正常无症状体检者作为正常对照组。

    1.1.2  试剂和仪器: Uu液体培养基采用法国梅里埃公司生产的支原体选择性液体培养基试剂盒，PCR扩增仪（PE2400型）为美国PE公司产品，Taq DNA聚合酶、DNA标准分子量marker购自华美公司。

    1.1.3  引物设计与合成: 从GeneBank中查到解脲脲原体多条带抗原（MBA）的基因全序列，参照Knox等[3-4]利用Array designer软件设计一对分群引物并送上海生物工程公司合成：MBA-F,5'-GTATTTGCAATCTTTTATATGTTTTTCG-3'；MBA-R,5'-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTTC-3'

    1.2  方法

    1.2.1  标本培养: 以无菌方法将待检样品直接接种于支原体选择性液体培养基，37 ℃培养24~36 h后观察结果，培养基由桔黄色变为红色诊断为Uu培养阳性。48 h后仍无颜色改变者为阴性。

    1.2.2  菌株分群: 直接取液体培养阳性的样本200 μl到1.5 ml的EP管中，10 000转/min离心3 min，弃上清。沉淀用PBS洗涤两次后加500 μl的无菌去离子水悬起, 100 ℃处理10 min后离心取1 μl作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系： 2.5 μl 10×buffer，0.25 μl Taq酶（5 U/μl），1 μl dNTP（2 mmol/L），2 μl引物（10 pmol/μl），1 μl模板，加无菌去离子水至25 μl。PCR反应条件：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 40 s, 60 ℃ 40 s,72 ℃40 s,共30个循环，最后72 ℃延伸7 min。扩增产物的检测：取扩增产物10 μl于2.0%琼脂糖（内含0.5 μg/L溴乙锭）TBE缓冲系统进行电泳，紫外光下检测。

    2  结果

    2.1  不同人群泌尿生殖道样本Uu培养结果（见表1）表1  不同人群泌尿生殖道样本Uu培养结果（略）注：与正常对照组比较*P<0.01，**P>0.05数据显示：不孕症患者、习惯性流产和早产患者与宫颈炎患者中Uu分离阳性率均明显高于正常对照组(25%)。但χ2检验发现，习惯性流产、早产患者和宫颈炎患者与正常人间的差异具有显著性意义（P<0.01），而不孕症患者与正常人间的差异则无显著性（P>0.05）。

    2.2  Uu生物分群与疾病间的关系通过表型和基因型可以将解脲脲原体分为2个生物群，以前的研究认为不同的生物群与细菌的致病性间具有相关性[5-6]。通过对解脲脲原体多条带抗原基因PCR扩增产物进行电泳分型，将在403 bp或404 bp处出现条带的样本归为生物群1型(Up)，扩增产物长度为448 bp的样本归为生物群2型(Uu)。不同泌尿生殖道疾病患者中分离出的解脲脲原体的分群结果见表2。表2  不同人群的Uu生物群分类（略）结果显示，在习惯性流产和宫颈炎患者中生物群2型的检出率明显高于对照组(P<0.01), 但不孕症组与正常对照组则无差异(P>0.05)。

    3  讨论

　Uu是人类泌尿生殖道常见的共生微生物,Uu在泌尿生殖道寄居与感染的关系是当前一个比较令人们关注的课题。由于Uu两个生物群在生物学特性上存在许多差异,临床检查到Uu, 并不能确定是携带状态还是感染状态,这给诊断与带来一定的困难。因此近年来有人试图从Uu 的两群临床流行病学特征上寻找Uu 寄居与感染之间关系。PCR 具有敏感性高、特异性强、操作简便等特点,广泛用于微生物的检测。已有的研究显示靶序列如16 SrRNA 基因、脲酶基因亚单位、MBA 基因5′端采用PCR 法可以鉴别Uu 的这两个生物群[7-8]。本文采用PCR 法进行Uu 生物群和血清型的检测,结果显示MBA 基因对检测Uu 的血清型具有潜在价值。我们设计合成了检测Uu MBA5′端靶序列,对Uu14 个血清型检测时发现第1 群扩增片段长度为403 bp或404 bp,第2 群为448 bp,因此可以通过电泳对两个生物群Uu进行鉴别。通过支原体选择性培养基对临床泌尿生殖道分泌物标本进行检测是多年来认为检测解脲脲原体的金标准，但它不能对解脲脲原体的不同生物群进行分析。利用MBA（Multiple Band Antigen）基因间的微小差别设计引物进行Uu生物分群的PCR方法经多年的应用，敏感性好，特异性高，能用于对液体培养基培养阳性的标本进行确认及生物分群。孔繁荣等[9]研究显示，在正常无症状人群中，25%携带有解脲脲原体，其中78%属于生物群1型，说明生物群1型可能主要以寄居状态存在于泌尿生殖道。我们检测的260份标本中，有35%检测到解脲脲原体的存在。在习惯性流产、早产和宫颈炎患者中解脲脲原体的分离阳性率明显高于正常人，表明Uu可能是习惯性流产、早产和宫颈炎的重要致病因子。从分类上来看，习惯性流产、早产和宫颈炎患者中分离出的解脲脲原体生物群2型的比例明显提高，提示生物2群的感染可能与这两类疾病相关。因此，如果从患者泌尿生殖道样本中分离出解脲脲原体生物群2型，应该及时治疗以阻止其继续侵袭,以免导致更为严重的后果。本研究中不孕症患者解脲脲原体的分离阳性率及其生物分群与正常对照间的差异无显著性，与范宝剑等[10]的研究报道不一致，这可能与我们的样本量太少和不同地区惟患因子差异等因素有关。

    [参  考  文  献]

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  　  [2]     Hudson MM, Talbot MD. Ureaplasma urealyticum[J]. Int J STD AIDS,1997,8 (9):546-551.  

　   [3]     Kong F, Zhu X,Wang W, et.al. Comparative analysis and serovar-specific identification of multiple-banded antigen genes of Ureaplasma urealyticum biovar 1[J]. J Clin Microbiol,1999,37(3): 538-543. 

　    [4]     Knux CL, Giffanl P, Timms P. The phylageny of Ureaplasma urealyticum based on the mba gene fragment [J]. Int J Syst Bacterial, 1998 ,48(R4) :1323一1331.  

　   [5]     覃春容，张帝开.解脲脲原体的生物群、血清型与致病[J]. 微生态学杂志，2004，16(2): 125-126. 

　    [6]     任  翊,刘朝晖,朱学骏,等.妇科门诊人群宫颈解脲脲原体检出情况及分群分型[J].中国皮肤性病学杂志,2002,16(3):155-157. 

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　    [9]     孔繁荣,朱学骏,王雪虹,等. 应用聚合酶链反应对淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体感染现状的调查[J].中华流行病学杂志，1995，15(4):217-219.

　     [10]     范宝剑，汪  宁，赵  季,等.解脲脲原体血清型与不育关系的研究[J].南京铁道医学院学报，1999，18(2):102-104.