小檗碱对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

【摘要】  目的：观察小檗碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响。方法：将组织贴块法培养的大鼠PASMCs随机分为对照组，AngⅡ模型组，小檗碱高、中、低剂量组，硝苯地平组和溶剂组。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测各组PASMCs的生长情况，以流式细胞术检测细胞周期构成比和增殖指数(PI)，以乳酸脱氢酶(LDH)法检测小檗碱对细胞的毒性作用。结果：小檗碱可明显降低Ang Ⅱ诱导PASMCs的增殖能力，使PASMC3的G0/G1期构成比显著升高(P<0?05)，PI显著下降(P<0?05)，且对PASMCs释放LDH无影响。结论：小檗碱能抑制AngⅡ诱导的PASMCs增殖，且与细胞毒性作用无关。

【关键词】  血管紧张素Ⅱ 肺动脉平滑肌细胞 肺动脉高压 小檗碱 增殖

    ［Abstract］Objective：To investigate the effect of berberine on proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs)in rats. Methods：PASMCs cultured by tissue_sticking method were randomly divided into control，model，berberine(105～107?mol/L)，nifedipine，and vehicle groups. The cells proliferation abilitiy was determined by mono_nuclear cell direct cytotoxicity assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. Results：Berberine significantly inhi_bited the proliferation of PASMCs，and up_regulated significantly the constituent ratio of PASMCs G0/G1 cell cycle，and down_regulated proliferation index. Conclusion：Berberine antagonizes the proliferation of PASMCs induced by angiotensin Ⅱ.

    ［Key Words］angiotensin Ⅱ；pulmonary artery smooth muscle cell；pulmonary hypertension；berberine；proliferation

    肺动脉高压的发病机制尚不十分清楚，目前亦无满意的方法。它的两大基本病理改变是肺血管收缩和肺血管平滑肌构型重建，因此，抑制肺血管收缩，改善肺循环血流动力学以及阻止肺血管平滑肌细胞增殖、增强是治疗其关键［1～3］。钙拮抗剂(硝苯地平等)是近年来临床常用的抗肺动脉高压药物，与在逆转肺动脉高压时血管构型重建方面的机制和抑制细胞内游离Ca2+浓度的增高有关。小檗碱是一种异喹啉生物碱，能抑制小肠黏膜分泌，扩张血管，抗血小板凝集及改善肺缺血再灌损伤等。它也是一种钙拮抗剂，能抑制神经细胞、心肌细胞、平滑肌细胞等细胞内游离Ca2+浓度的增高［1～4］。有报道，平滑肌细胞的增殖与细胞内游离Ca2+浓度的增高有关，且平滑肌细胞的异常分化与增殖是血管重构，肺动脉高压等发生、的基础。本实验旨在研究小檗碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响。

    1材料与方法

    1?1实验动物

    SD大鼠［广州第一军医大学动物中心提供］12只，雌雄不拘，体质量200～250?g。

    1?2药品及器材

    小檗碱，硝苯地平(上海第十七制药厂，。实验前用DMSO溶解配成)，AngⅡ(Sigma公司，美国)，胎牛血清，M199培养基、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)，凯基MTT细胞增殖检测试剂盒以及细胞周期检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司，中国)；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；倒置相差显微镜(上海光学仪器厂，中国)；超净工作台(苏州净化设备有限公司，中国)；CO2 培养箱(Thermo Forma公司，美国)，multiskan spectrum酶标仪(Thermo Labsystem公司，芬兰)；FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)。

   1?3大鼠PASMCs制备

    大鼠PASMCs制备见［5，6］，但稍加改进：无菌条件下迅速取出大鼠体内肺动脉片段，按组织贴块法将平滑肌组织块移入培养瓶，加入M199培养液(含体积分数20%的胎牛血清)，于37?℃培养箱密闭培养，静置5?d 左右可见细胞从组织块周围呈梭形生长出来，换液体1次/2?d，细胞逐渐重叠生长达多层，高低起伏呈“峰、谷”状。细胞生长融合时，用质量分数0?1%的胰蛋白酶消化，传代培养。经小鼠抗大鼠α_SM actin单克隆抗体免疫细胞化学鉴定，可见视野内细胞染色普遍呈阳性，实验用第3～4代细胞。

    1?4培养的PASMCs细胞鉴定

    用actin免疫组化染色进行鉴定：试剂采用兔抗大鼠α_SM actin、S_P抗兔试剂盒。将细胞用胰蛋白酶消化、离心，滴于经体积分数0?2%的多聚赖氨酸粘片处理的载玻片上，SABC法对PASMCs进行actin免疫组化染色，DAB显色。

    1?5实验分组

    将PASMCs随机分为对照(正常血管平滑肌细胞)组，AngⅡ(10-6?mol/L)模型组，小檗碱高剂量(10-5?mol/L+AngⅡ10-6?mol/L)、中剂量(10-6?mol/L+AngⅡ10-6?mol/L)、低剂量(10-7?mol/L+AngⅡ10-6?mol/L) 组，硝苯地平(10-6?mol/L+AngⅡ10-6?mol/L)组和溶剂(体积分数0?1%的DMSO+AngⅡ10-6?mol/L)组。7组用无血清培养基孵育24?h后，改为含10%胎牛血清的M199培养液，在37?℃、5%?CO2普通细胞培养箱内孵育24?h。

    1?6PASMCs细胞增殖能力测定

    用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)将细胞消化制成5×107个/L的细胞悬液，以每孔100?μL接种于96孔培养板中，用含10%的胎牛血清的M199培养液置37?℃、5%?CO2细胞培养箱中培养24?h，将培养的PASMCs按1?5分组培养后，每孔再加入50?μL?MTT溶液，在37?℃继续孵育4?h后吸出上清液，每孔加入150?μL?DMSO，用平板摇床摇匀，用酶标仪在550?nm波长处检测每孔吸光度(OD值)。

    1?7PASMCs细胞周期测定

    取第3代生长良好的PASMCs，按1?5分组培养后分别消化，离心，收集细胞于离心管，再用PBS洗涤细胞1次(离心1?000?r/min，10?min)，收集并调整细胞浓度为1×106/mL的细胞悬液，用体积分数70%的冷乙醇固定，4?℃保存。染色前用PBS洗去固定液，加100?μL?RNA酶(50?mg/mL)，37?℃水浴30?min，再加入400?μL碘化丙锭(10?μg/mL)染色混匀，4?℃避光30?min，上机检测。微机处理并分析细胞增殖动力周期中各期细胞数所占总细胞的百分比。并按分裂增殖指数(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%细胞分裂PI。

    1?8LDH检测

    收集7组培养液，按LDH法检测与细胞毒性有关的LDH活力。

    1?9统计学处理

    实验结果用SPSS11?0统计软件分析，结果以±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较。

    2结果

    2?1PASMCs细胞鉴定结果

    用倒置相差显微镜观察α_SM actin免疫组化染色，对PASMCs进行鉴定(图1a、1b，封2)。可见视野内的细胞染色普遍呈阳性反应，即细胞浆内呈现棕黄色反应，胞核不着色，表明细胞含有actin，证明培养的细胞为PASMCs。

    2?2小檗碱对PASMCs增殖能力的影响

    与对照组比，AngⅡ模型组OD值明显提高，提示AngⅡ可促进PASMCs的增殖，与AngⅡ模型组比，小檗碱各剂量组OD值均明显下降(P<0?01)，表明小檗碱对AngⅡ刺激的PASMCs增殖具有抑制作用，并呈现一定的剂量依赖关系(表1)。表1各组平滑肌细胞的OD值

    2?3细胞周期分析

    与对照组比，AngⅡ模型组G0/G1期PASMCs百分率明显减少(P<0?01)，S期和G2/M期PASMCs百分率明显增加(P<0?01)，PI明显增加(P<0?01)，提示AngⅡ能诱导PASMCs的增殖。与AngⅡ模型组比，小檗碱各剂量组G0/G1期PASMCs百分率均明显增加（P<0?05），小檗碱高、中剂量组PI明显减少(P<0?05)，低剂量组PI无明显变化(表2)。 表2各组平滑肌细胞的细胞周期及PI

    2?4细胞毒性分析

    药物对细胞生长的抑制作用可能与抗增殖活性有关，也可能与药物的细胞毒性有关(图2)。AngⅡ模型组，硝苯地平组，小檗碱各剂量组的PASMCs中LDH活力无统计学意义，可见小檗碱抗增殖活性与细胞毒性无关。

  3讨论

    肺动脉高压时，血管平滑肌在血管切应力增加及神经体液等因素的改变下，动脉壁的肌化及平滑肌细胞表型的转化，血管平滑肌细胞发生增殖、肥大，形成了高血压病与血管平滑肌细胞异常增殖之间的恶性循环［9， 10］。血管平滑肌细胞异常增殖是高血压等血管增生性疾病的病理基础［11， 12］。平滑肌细胞增殖、迁移可使血管壁增厚，管腔变窄，阻力增加而引起BP升高；动脉粥样硬化也以内皮损伤、血小板聚集、生长因子释放致平滑肌细胞增殖为基本病变。

    对于细胞增殖的研究方法较为常用的是细胞周期分析法。MTT法测定的是活细胞数，而流式细胞仪技术是根据细胞所处的不同时期DNA含量的不同原理，区分出处于不同时相的细胞。细胞周期由G0G1期、S期、G2M期组成，且是DNA合成期，S期细胞构成比增加，反映细胞增殖活跃。细胞PI是指处于S期和G2M期细胞之和占总细胞数的比例，它反映该群细胞的增殖速度。

    AngⅡ能促进VSMCs增殖，机制：AngⅡ与AT1受体结合，通过G蛋白激活下游的信号分子磷脂酶C，水解膜磷脂生成甘油二酰和三磷酸肌醇，进一步激活下游的信号分子，最终导致PASMCs增殖。而AngⅡ与AT1受体结合后，促使细胞内Ca2+浓度升高是触发细胞增殖相关信号转导的始动因素［7］。本实验用MTT法进行活细胞数目分析，以流式细胞术检测细胞周期构成比，结果说明AngⅡ作为一种生长因子在体外有促培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖作用，这与报道的结果一致［8，9］。与AngⅡ模型组比，小檗碱各剂量组OD值均显著降低(P<0?01)，随着剂量的增加，G0/G1期PASMCs百分率随之增加，S期和G2M期的PASMCs百分率随之减少(P<0?05)，细胞PI相应减少(P<0?05)。抑制了细胞由G0/G1期向S、G2M期转化，提示小檗碱可抑制PASMCs的增殖，其抑制作用呈剂量依赖性。而且对细胞生长的抑制作用与细胞毒性无关。由此我们推断，作为钙拮抗剂的小檗碱抑制PASMCs增殖的机制，可能是通过抑制细胞内的游离Ca2+浓度的增高而阻断了AngⅡ与受体结合后的一系列信号转导途径实现的，具体的信号转导途径有待深入研究。

【】
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