衰老海马神经元的体外鉴
【摘要】 目的：鉴定培养的海马神经元衰老状况。方法：利用SD新生鼠进行海马神经元原代培养，分别取培养6、12和20d的神经元进行衰老相关β半乳糖苷酶(SA_β_GAL)的细胞化学染色。结果：随着培养时间的延长，SA_β_GAL阳性率增加(P<0?01)。结论：海马神经元可能随着培养时间的延长而衰老细胞增加。
【关键词】 神经元 衰老 衰老相关β半乳糖苷酶
［Abstract］Objective：To identify senescent cultured hippocampal neurons. Methods：Hippocampus were dissected and cultured from new_born SD rats. The cytochemical staining of senescence associated β_galactosidase(SA_β_GAL)was applied to cultured neurons for 6、12 and 20 days. Results：The positive staining of SA_β_GAL increased with prolongation of the culture period (P<0?01). Conclusion：The senescent hippocampal neuron increases with the culture period.
［Key Words］neuron；ageing；senescence associated β_galactosidase
衰老相关β半乳糖苷酶(Senescence associated β_galactosidase，SA_β_GAL)在衰老细胞中表达升高，目前已成为一个被广泛采用的衰老生物学标记物［1， 2］。然而大多数研究是在复制细胞中应用SA_β_GAL来标记衰老细胞［3］，而神经元属于静止细胞，其是否能够用于检测衰老神经元，目前还未得到证实，因此在应用上应加以验证。研究发现，衰老细胞从形态学上表现为细胞变大，变扁平［4］。本研究拟对培养不同天数的海马神经元进行SA_β_GAL染色，以鉴定衰老海马神经元并结合形态学观察，从而验证SA_β_GAL标记衰老海马神经元的可靠性。
1材料与方法
1?1海马神经元原代培养SD新生鼠(种鼠由中山大学广州北校区动物中心提供，新生鼠在汕头大学医学院动物中心繁殖)5～6只，体质量4～6g。全身体积分数75%的酒精消毒，断头取脑，将整个脑组织置于冷的HBSS(无Ca2+，Mg2+)平衡液中，利用弯头玻璃棒将两侧海马完整取出。HBSS洗4次，去除混杂的血管和血液。胰酶消化：用剪刀将海马组织剪成1mm3小块，HBSS洗4次，质量分数0?25%的胰酶37℃消化15min。终止消化：加入终浓度为体积分数10%的胎牛血清孵育5min终止消化，随后HBSS洗4～5次，去除残留胎牛血清。吹打细胞：在15mL离心管中加入5mL Neurobasal A(GIBCO公司，美国)，用Pasteur管吹打组织碎块，将浑浊的上清液收集到另一个15mL离心管中，200g离心10min，弃上清液。接种细胞：沉淀用Neurobasal A/B27（Sigma公司，美国）重悬，在24孔板中接种在100mg/mL poly_L_lysine处理过的盖玻片上，密度约(5～8)×105个/mL，在37℃，体积分数5%的CO2培养箱中培养。在培养第5d加入10mmoL阿糖胞苷抑制胶质细胞和纤维母细胞生长，从接种第6d起可进行实验。分别取细胞接种后第6、12和20d的培养细胞在体积分数4%的多聚甲醛中室温固定15min，_20℃冰箱保存备用。
1?2SA_β_GAL细胞化学染色
接种细胞的盖玻片在室温下放置约30min，用X_Gal洗液(100mmol/L Na3PO4；2mmol/L MgCl2；质量分数0?01%的脱氧胆酸钠)洗3次，每次15min，用X_Gal染液(100mmol/L Na3PO4，2mmol/L MgCl2，150mmol/L NaCl，质量分数0?01%脱氧胆酸钠，质量分数0?02%的NP_40，5mmol/L铁氰化钾，5mmol/L亚铁氰化钾，1mg/mL X_gal)在37℃避光孵育16～18h，PBS清洗3次，质量分数0?1%的核固红室温对比染色20min。晾干后中性树胶封固，光镜下观察，拍片，计数。
1?3统计学处理
实验结果用±s表示，运用SPSS12?0进行统计分析，两组间比较用独立样本t检验。
2结果
SA_β_GAL细胞化学染色结果显示，随着培养天数的增加，SA_β_GAL阳性率升高，培养6 d的神经元SA_β_GAL阳性表达较少，而12、20d的神经元中的阳性表达明显增加(P<0?01，表1)，神经元细胞形态学变化不明显。表1海马原代培养神经元SA_β_GAL染色的阳性率
3讨论
SA_β_GAL的pH值为6时，在衰老细胞中活性升高，因此成为比较普遍应用的衰老生物学标记物［1］。多数研究应用于复制衰老，尤其是指真核细胞在完成有限分裂次数后，丧失合成DNA的能力，导致增殖能力丧失而仅维持细胞基本的代谢能力的状态，比较经典的复制衰老的细胞模型是人二倍体细胞［2， 5］。然而，神经元属静止细胞，在体外培养中不再增殖和分裂，因此，SA_β_GAL在这类细胞中的应用受到挑战。本研究结果表明，在延长培养的海马神经元中，SA_β_GAL的阳性率明显增加，提示延长培养的神经元处于衰老状态。除SA_β_GAL标记外，衰老细胞还具有细胞变大，变扁平的形态学特点，然而在本研究中，延长培养的神经元形态学改变不明显，因此，SA_β_GAL是一个比较敏感的标记衰老细胞的生物学指标。在以往的研究中，我们曾应用SA_β_GAL分别在不同年龄大鼠的大脑皮层和海马区成功标记了衰老神经元［6，7］，本结果进一步验证了SA_β_GAL作为衰老神经元标记物的可靠性。
【】
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