丙泊酚 瑞芬太尼对大鼠缺血再灌注损伤肺泡细胞凋亡的影响
作者：郭晓军 曹定睿* 郭晶宇 杨春艳 张文颉
【摘要】 目的：探讨麻醉药丙泊酚(propofol)和瑞芬太尼(remifentanil)对大鼠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IR)后肺泡细胞凋亡的影响。方法：建立大鼠原位热缺血再灌注模型，于结扎前、缺血30 min、再灌注1 h、2 h、4 h给予药物干预，采取肺组织及右房血标本,测定血氧分压，肺组织湿/干重比,并作光镜和透射电镜观察组织细胞形态及超微结构,确定凋亡发生，流式细胞仪测定肺组织中凋亡情况。结果：缺血再灌注组与假手术组比较，血氧分压降低，肺组织湿/干重比增高，肺泡细胞凋亡指数增高，丙泊酚组、瑞芬太尼组与缺血再灌注组比较，血氧分压增高，肺组织湿/干重比降低，肺泡细胞凋亡指数下降。结论：丙泊酚和瑞芬太尼对IR后肺泡细胞凋亡有抑制作用。
【关键词】 丙泊酚 瑞芬太尼 IR 肺泡细胞凋亡
Abstract Objective:The experiment will research the effect of propofol and remifentanil against the apoptosis of alveolar cells induced by ischemia reperfusion injury.Methods:After the establishment of the ischemia reperfusion in situ models, all rats will give pharmaceutical intervention.Before the ligation,after 30 min of the ischemia and after 1 h,2 h,4 h repectively of the reperfusion,We get the lung tissue and blood samples of the right atrium,then detect the partial pressure of blood oxygen,the wet weight/dry weight ratio of lung tissue and observe the configuration and ultrastructure of the tissue cells to confirm that the apoptosis happens and detect apoptosis of alveolar cells with the flow cytometer.Results: Compared with shame group，Ischemia-reperfusion group showed decreased PaO2 and elevated wet/dry ratio. Apoptotic index of lung was elevated.Compared with Ischemia-reperfusion group，propofol treatment group and remifentanil treatment group showed elevated PaO2 and decreased wet/dry ratio. Apoptotic index of lung was decreased.Conclusions:Propofol and remifentanil have suppression to the apoptosis of alveolar cells induced by ischemia reperfusion injury.
Key words Propofol；Remifentanil；IR；Apoptosis of alveolar cells
肺IR可在多种临床情况下发生,是肺移植早期和心肺转流术后肺功能障碍的重要原因，有报道在肝脏、心脏、肾脏、神经系统、视网膜等多种脏器IR损伤过程中均出现细胞凋亡,并对IR损伤的和该脏器预后具有重大意义。目前国内外关于麻醉药物对肺IR中肺泡细胞凋亡的研究较少,为此,我们研究了麻醉药物丙泊酚和瑞芬太尼对肺IR中肺泡细胞凋亡过程中的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与肺缺血再灌注损伤模型的制备
雄性健康Wistar大鼠(山西医科大学实验动物中心)126只，体重280 g～300 g，建立大鼠单肺原位热缺血再灌注模型。大鼠分六组：空白组6只。假手术组（仅行右侧开胸和右肺门穿带）、手术组（缺血再灌注组）、丙泊酚组以及瑞芬太尼组各30只，并再随机分为5小组,每组6只。各小组依照结扎前及缺血30 min、再灌注1 h、2 h、4 h五个时点取材待检。
活结阻断法阻断右肺静脉和右主支气管，使右肺处于萎陷状态，同时将潮气量减少1/3，热缺血1 h后依次开放右肺静脉、右主支气管和右肺动脉，使右肺充分膨胀。
1.2 实验方法
大鼠麻醉诱导用戊巴比妥钠(30 mg/kg)，用戊巴比妥钠(15 mg/kg)追加维持麻醉。气管插管机械通气，建立静脉通道供输液用。动物缺血30 min后丙泊酚组给予5 mg/(kg·h)。瑞芬太尼组给予0.5 μg/(kg·min)。实验结束时即采左心房血测定血氧分压,测定肺组织湿/干重比,并结合光镜观察评价肺损伤。通过电镜观察细胞形态及超微结构,从形态学角度确定凋亡发生。采用流式细胞仪对右肺中叶凋亡细胞进行定量检测,按细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinV杭州联科公司)说明书操作，取右肺中叶组织,置于无菌培养皿中,剪碎,置于过滤离心管(滤过直径35 μm ,Becton Dickinson ,美国) 中,4 ℃,1 000转 离心5 min ,去上清后加入PBS（磷酸盐缓冲液） ,混匀成细胞悬液。左、右肺组织细胞凋亡率检测使用Annexin V/ PI 试剂盒,将细胞悬液计数调整成1×106/mL 的浓度,用Binding buffer 液冲洗,4 ℃, 1 000转离心5 min ,去上清后依次加入250 μL Binding buffer、5 μL FITC AnnexinV 和5 μL PI,混匀,冰浴反应10 min 后,上流式细胞仪(Coulter.elite.esp ,美国) 检测。激发光波长为488 nm,FITC发射波长为525 nm,PI发射波长为610 nm。正常细胞FITC及PI均低染( FITC- PI-),凋亡细胞FITC高染而PI低染( FITC+ PI-),死亡细胞FITC及PI均高染(FITC+ PI-)；并获得细胞凋亡率。
1.3 统计方法
实验数据用x±s表示，采用方差分析方法,相关性研究采用双变量相关分析法,Pearson相关系数。所有统计分析用SAS9.0统计软件在计算机上完成。
2 结果
2.1 血气及酸碱平衡变化
假手术组变化不明显(P>0.05)。损伤组和药物使用组再灌注后PaO2逐渐下降(P<0.05),其中损伤组下降幅度大于两个药物使用组，再灌注4 h药物使用组PaO2较IR组明显升高(P<0.05)。再灌注pH值呈下降趋势, 损伤组变化程度大于药物使用组,HCO3-趋于下降，但无统计学差异。
表1 血气 酸碱平衡变化（略）
与假手术组比较＃P<0.01，△P<0.05，*P<0.05；与IR组比较△P<0.05，☆P<0.05
2.2 肺组织湿干比重
再灌注损伤后，肺湿干比重明显升高(P<0.01)，以损伤组最甚。丙泊酚组和瑞芬太尼组虽然也有湿干比重的升高，但是较损伤组轻微(P<0.05)。而且丙泊酚组和瑞芬太尼组之间无明显统计学差异。
表2 肺组织湿干比值变化（略）
与假手术组比较＃P<0.01，△P<0.05，☆P<0.05；与IR组比较△P<0.05，☆P<0.05
2.3 细胞凋亡率（流式细胞术）
假手术组无明显变化，IR组凋亡率明显升高，丙泊酚组和瑞芬太尼组升高趋势较损伤组缓和(P<0.01)。
表3 肺泡细胞凋亡率（略）
与假手术组比较＃P<0.01，△P<0.05，☆P<0.05；与IR组比较△P<0.05，☆P<0.05
2.4 动脉血氧分压、湿干比重与细胞凋亡率的关系
双变量相关分析结果显示，动脉血氧分压与肺湿干比重之间存在负相关关系（r=-0.44187, P=0.0001<0.05）。肺泡细胞凋亡率与血氧分压的Pearson相关系数r＝-0.87009、P＝0.0011<0.05,与肺组织湿/干重比的相关系数为r＝0.45664、P＝0.0004<0.05,提示肺功能损害与细胞凋亡有显著的相关性。
2.5 镜下观察
假手术组肺组织结构基本无异常。损伤组、丙泊酚组和瑞芬太尼组肺泡间隔充血、水肿,毛细血管扩张,大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润和微血栓形成,肺泡腔内可见淡红色渗液和出血,局部肺不张（见图1）。损伤组病理改变明显重于丙泊酚组和瑞芬太尼组。IR后,肺组织透射电镜观察可见肺泡Ⅱ型上皮细胞增多,并且有不同程度的形态学改变,细胞体积缩小,胞膜完整，外凸或内陷，细胞核呈多形性,核固缩，染色质边集，凋亡小体形成（见图2）。
3 讨论
肺IR可在多种临床情况下发生,是肺移植早期和心肺转流术后肺功能障碍的重要原因。本试验中，PaO2和pH值在缺血初期变化不明显，再灌注1 h后呈明显下降趋势,同时肺组织湿干比值、细胞凋亡率也呈明显升高，提示IR所导致的凋亡发生在再灌注之后，这与以往的研究相吻合［１，２］。
电镜观察发现,再灌注损伤后肺泡Ⅱ型细胞数量明显增加,并发生细胞凋亡，同一视野中肺泡Ⅰ型细胞则少见凋亡的特征性改变，Fischer等［３］也指出IR中凋亡的主要细胞是肺泡Ⅱ型细胞。
相关分析结果显示，再灌注后湿干比重与再灌注后动脉血氧分压之间为负相关关系，肺泡细胞凋亡率与血氧分压为负相关关系,与肺组织湿/干重比的相关系数为正相关关系,提示肺功能损害与细胞凋亡有显著的相关性。湿干比重高，肺组织水肿明显，从而呼吸膜增厚，气体交换障碍，使动脉血氧分压下降，肺泡细胞凋亡率增高。
缺血前各组动脉血氧分压无明显差异，而在再灌注后，丙泊酚组动脉血氧分压明显高于IR组(P<0.05)；湿干比重虽然也有升高，但是较IR组轻微(P<0.05)；肺泡细胞凋亡率较假手术组升高，但其结果明显优于IR组(P<0.05)，显示剂量的丙泊酚能够减缓肺泡细胞凋亡的进程。IR期间有大量氧自由基产生，自由基可能直接损伤DNA ,攻击蛋白质,影响核基因转录,也可直接作用于细胞质膜,引起脂质过氧化,从而影响信号转导系统,激发有关调控基因,导致肺泡细胞凋亡。丙泊酚具有很好的抑制氧自由基介导的脂质过氧化作用，主要是干扰了脂质过氧化的夺氢过程，形成的酚基进一步与脂质过氧化基生成无活性产物，中断脂质过氧化的链式反应。丙泊酚还具有很好的脂溶性，可以聚集在细胞膜上，提高细胞抗氧化损伤的能力，从而对凋亡的发生产生抑制作用［４］。
瑞芬太尼组的血气分析、湿干比值、细胞凋亡率等指标测定结果也明显优于IR组，说明瑞芬太尼在治疗剂量对IR时的细胞凋亡过程有明显的缓解作用，能够减轻肺组织IR及凋亡的程度，瑞芬太尼对肺泡细胞凋亡的抑制机制目前国内外尚无明确结论，继往实验研究表明，麻醉性镇痛药对于急性肺损伤炎性介质的表达有下调作用，瑞芬太尼可能通过抑制细胞表面粘附分子的表达以及炎性细胞因子的释放下调肺泡细胞凋亡的表达［６］。
目前研究已表明：凋亡相关基因Bax和Bcl-2蛋白分布于肺脏细胞胞体，Bcl-2的表达上调可以防止多种原因引起的细胞凋亡，这也可能是瑞芬太尼对肺泡细胞凋亡的抑制机制之一。
本试验中，瑞芬太尼组和丙泊酚组均能有效的抑制肺泡细胞凋亡的发生、，瑞芬太尼组测定结果在数值上有优于丙泊酚组的迹象，但两者之间统计学差异不明显，提示两者通过不同的机制作用于肺泡细胞凋亡的过程 。
综上所述，丙泊酚和瑞芬太尼对缺血再灌注损伤后肺泡细胞凋亡有明显的抑制作用。
【】
［１］ 张 赛,陈如坤,林 敏等.大鼠肺IR中肺泡细胞凋亡的动态观察. 中华医学杂志，2004，84（19）：1 597～1 600．
［２］ Harkin DW， BarrosD，sa AA，et al.Circulating neutroPhil Priming and systemic inflammation in limb ischaemia-reperfusion injury Int Angiol,2001，20(1):78～89．
［３］ Fischer S, Cassivi SD, Xavier AM,et al. Cell death in human lung transplantation: apoptosis induction in human lungs during ischemia and after transplantation［J］.Annals of Surgery，２０００，231(3):424～４31.
［４］ Ozatamer,Tasoz,Kilinc,et al.Propofol attenuates myocardial lipid peroxidation during coronary artery bypass grafting surgery. BJA: British Journal of Anaesthesia，２００２，89(2):242～246.
［５］ Feng Zhang,MD,PhD,et al.The Expression of Proinflammatory Cytokines in the Rat Muscle Flap with Ischemia-Reperfusion Injury Ann Plast Surg，2005，54:313～317．
［６］ Frass M, Gmeiner B，Sandor,et al.Effects of remifentanil on neutrophil adhesion. Acta Anaesthesiologica Scandinavica，２０００，44(10):1 232～1 237.
