人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤实验

【摘要】  目的：探讨人肝癌细胞总RNA电转染人树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)后诱导特异性效应T细胞及其效应T细胞抗肝癌的特异性。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为未成熟树突状细胞（Immature Dendritic Cell,imDC）和成熟树突状细胞（Mature Dendritic Cell,mDC）。培养肝癌细胞，Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA。通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入imDC内；观测电转染的转染率；采用免疫细胞化学检测电转染前后的imDC形态及其表面标志；通过混合淋巴细胞实验，获取mDC激活的特异性效应T细胞。用MTT法测定效应T细胞的抗肝癌特异性。结果：电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入imDC。电转染前后imDC分子表达无显著差异，mDC的分子表达与imDC相比发生了变化。转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞。效应T细胞可特异性的杀伤人肝癌细胞，而对不相关的MG-63细胞无特异性的杀伤作用。结论：电转染不影响imDC的形态和原有的蛋白表达；转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞；效应T细胞具有抗人肝癌细胞的特异性。

【关键词】  树突状细胞 肝癌细胞 总RNA 转染 人

    Abstract  Objective:To investiage whether the electransfection of human dendritic cells(DCs) with total RNA of hepatocarcinoma cells could induce the specific effective T cells,then analysis the specificy that effective T cells kill target hepatocarcinoma cells.Methods:Monocytes obtained form human peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into immature DCs and mature DCs in the presence of cytokines in vitro.The total RNA of hepatocarcinoma cells are extracted by Trizol and are eletransfected into monocyte-derived immature DCs.The success rate of electransfection is measured.We use immunocellchemical staining to observe the changes of imDCs’morphology and molecule expression between before and after electransfection of human dendritic cells(DCs)with total RNA of hepatocarcinoma cells;we harvest effective T cells by mixed lymphology reaction,in which gradually mature DCs activate T cells,then we examine the specificity that effective T cells kill target hepatocarcinoma cells.Results:Electransfection can make RNA into imDC successfully.There is no significant difference in imDC molecule expression after the electransfection.There is different molecule expression between imDC and  mDC. DCs with total RNA of hepatocarcinoma cells can activate specifically T cells into effective T cells which can kill hepatocarcinoma cells specifically while not MG-63 cells.Conclusion:Eletransfection doesn’t change the morphology and molecule expression;DCs with total RNA of hepatocarcinoma cells can make activation of T cells and specificity that the effective T cells kill hepatocarcinoma cells is examined.

    Key words  Hepatocarcinoma；Total RNA；Electransfection；Dendritic Cell；Human

    肝癌的手段有多种，但对于进展期肝癌，仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题。近年来报道肿瘤细胞RNA转染树突状细胞（DC）可以诱导强烈的抗肿瘤免疫，但在用RNA电转染树突状细胞（DC）的方法尚无报道，我们研究了肝癌细胞株Bel-7402总RNA电转染的树突状细胞（DC）对T细胞的体外激活效应，分析其抗肝癌的特异性。

   1  材料与方法

    1．1  材料

    新鲜人外周血，购自北京市血库。人肝癌细胞株Bel-7402，由北京大学基础医学院免疫学系惠赠。RPMI-1640培养液，购自美国GIBCO公司。淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077 g/mL），购自上海试剂二厂。胎牛血清（FCS），新生牛血清（NCS），购自美国HYClone公司。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素2（rhIL-2）和重组人白细胞介素4（rhIL-4），购自德国R&D公司。尼龙毛（Scrubbed nylon fiber）diameter 3，318 cm，type 200，购自FENWAL USA。鼠抗人CD14、鼠抗人MHC-Ⅱ、鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人S-100、鼠抗人AFP、鼠抗人TERT蛋白单克隆抗体，即用型二步法生物素检测试剂盒（PV9000）、FITC标记的第Ⅱ抗体工作液、磷酸缓冲液（PBS，0.01 M，pH7.2～7.4）、多聚赖氨酸、DAB、Triton-100均购自北京中山生物技术有限公司。HEPES，购自Sigma公司。TRIZOL试剂盒、绿色荧光蛋白（GFP）mRNA，购自Invitrogen公司。DEPC购自鼎国生物技术公司。

    1．2  方法

    1.2.1  单核细胞、imDC的获得及培养 取正常人新鲜外周血200 mL，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMNC），在37 ℃和5%CO2饱和湿度条件下培养2 h，取贴壁细胞即单核细胞，加入RPMI-1640液、10%胎牛血清（FCS）和细胞因子rhGM-CSF(1 000 U/mL)；rhIL-4(500 U/mL)于37 ℃和5%CO2饱和湿度条件下培养。第7 d收获的细胞为imDC。

    1.2.2  肝癌细胞株Bel-7402总RNA的获得：常规方法对肝癌细胞株Bel-7402进行细胞培养。以Trizol一步法对培养的肝癌细胞进行总RNA抽提，-20 ℃保存。部分用于测定260 nm和280 nm分光光度值，估计纯度并定量，部分进行RNA电泳观察其18S和28S条带完整性。

    1.2.3  肝癌细胞总RNA电转染imDC并培养为mDC收集诱导7 d的imDC，以无血清培养液洗两次，调整细胞浓度为107个细胞/mL。人肝癌细胞总RNA、PBS、GFPmRNA分别以20 μg/0.4 mL与imDC在电转杯中混合。均在300V、500uS的条件下进行电转染。电转染后静置5 min，将细胞移出电转杯，用含20%FCS RPMI-1640培养液将细胞培养于6孔培养板中。24 h后再加入rhGM-CSF(1 000 U/mL)；rhIL-4(500 U/mL)；TNF-a(100 ng/mL)继续培养3 d，即为mDC。

    1.2.4  T细胞的获得：按上述获得单核细胞的方法，取非贴壁细胞即为淋巴细胞，将3×107/mL的淋巴细胞注入尼龙毛柱，放入37 ℃，5%CO2培养箱静置1 h。用预温的37 ℃含20%小牛血清RPMI-1640培养液洗柱，洗下的即为T细胞，加入RPMI-1640液、10%胎牛血清（FCS）和细胞因子rhIL-2(500 U/mL)于37 ℃和5%CO2饱和湿度条件下培养待用。

    1.2.5  混合淋巴细胞试验：取电转染人肝癌细胞总RNA的mDC和经电转染PBS的mDC，按1∶10的比例加入T细胞，混匀后在完全培养基和细胞因子rhGM-CSF(1 000 U/mL)；rhIL-4(500 U/mL)；rhIL-2(100 U/mL)于37 ℃和5%CO2饱和湿度条件下共同培养4 d，活化T细胞为效应T细胞。

    1.2.6  效应T细胞特异性杀伤肿瘤细胞实验：将按上述方法获得3 d后的两组T细胞（第一组为T细胞+DC+RNA、第二组为T细胞+DC+PBS）作为效应细胞，第三组为新鲜分离的未与DC共培养的T细胞为对照。在96孔板中，分别以人肝癌细胞Bel-7402和人骨肉瘤细胞MG-63作为阳性和阴性靶细胞，效靶比为30∶1，每孔的终体积为200 μL。每种条件设3个复孔，并以单纯效应细胞和单纯靶细胞作为对照。37 ℃，5%CO2恒温培养箱培养4 h后，每孔加入5 mg/mL（2.5 mg/mL）的MTT溶液20 μL，同时以不加细胞的孔做阴性对照。震荡1 h，放入37 ℃ 5%CO2恒温培养箱培养4 h。500 g，离心10 min，弃上清，并用滤纸吸干，直接加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），震荡15 min。ELAISA阅读计540 nm～600 nm（490 nm）波长测定各孔OD值。以上述MTT法在波长490 nm处测OD值。

    T细胞杀伤活性：靶细胞对照组OD值-实验组OD值-效应细胞OD值/靶细胞对照组OD值。

    1.2.7  数据处理：所得数据经SPSS11.0软件进行处理，样本均数的比较采用t检验。

    2  结果

    2．1  培养imDCs的形态学观察及表型分析

    细胞体积增大，形态为长梭形或不规则形，并向四周伸出不规则状的突起。表型分析:MHC-Ⅱ+、S-100+、CD86weak+、CD83weak+。

    2．2  肝癌细胞总RNA质量检测

    本试验中经Trizol提取的肝癌细胞总RNA，107细胞可得到4 μg～8 μg RNA，经RNA电泳，可见到完整的18S和28S条带，分光光度计检测OD260/ODS280=1.82＞1.8。证明所用RNA未降解，质量可靠。

    2．3  电转染人肝癌细胞总RNA后的imDC的形态学观察及表型分析

    电转染24 h后，细胞处于稳定状态，开始贴壁生长，已经观察不到细胞融合现象，有少量的死亡细胞呈脱壁生长，形态变差，但绝大多数细胞可恢复至电转染前的正常状态。24 h台盼蓝测电转后细胞死亡率为15%～25%。荧光显微镜下可见：在450 nm～490 nm的波长观察GFPmRNA电转染后的imDC，电转染4 h～5 h后imDC内表达黄绿色荧光，此荧光可持续表达24 h～30 h。细胞计数：细胞中表达GFP的细胞占细胞总数的49.07%。

    表型分析：接受电转染人肝癌细胞总RNA后的imDC表型无明显变化（P>0.05）：电转染前后imDC分子表达的图像分析见表1。 表1  电转染前后imDC表型图像分析结果

　　2．4  mDC的形态观察及表型分析

    细胞悬浮生长，体积较大，大小不等，呈圆形，细胞表面有突起，呈毛刺样，细胞突起变细，变多，细胞突起在培养液中可摆动或伸缩。细胞核为一个，居中。

    表型分析：mDC分子表达：MHC-Ⅱ+、CD86+、S-100+、CD83+。imDC与mDC分子表达有变化，图像分析见表2。表2  imDC与mDC表型图像分析结果

    2．5  混合淋巴细胞实验

    倒置相差显微镜下显示T细胞在DC周围成花环样聚集，形成细胞簇，少为3个～5个，多为15个～20个。

    2．6  T细胞特异性杀伤肿瘤细胞实验

    经人肝癌总RNA电转染的mDC刺激的T细胞，能特异性地杀伤人肝癌细胞，其杀伤能力与效应细胞的数量成正比，而对MG-63细胞不能有效地杀伤（P<0.05）。经电转染的PBS电转染的mDC刺激的T细胞，由于无抗原刺激，mDC不能刺激T细胞产生特异性的杀伤性T细胞，因此对两组靶细胞都不能有效地杀伤，组内间无差别（P>0.05）。未经mDC刺激的T细胞作为对照，由于缺乏mDC的抗原呈递和刺激作用，T细胞不具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力。见表3。表3  效应T细胞杀伤实验

    3  讨论

    DC是目前已知功能最强的专职抗原呈递细胞［１］，其在分化发育过程中存在两个不同的阶段，作为未成熟的DC，具有摄取、处理抗原的能力并存在于全身淋巴组织中，一旦发育为成熟的DC，抗原捕获能力丧失，成为能激活静息T细胞、激发初始免疫反应的抗原呈递细胞［２，３］。GM-CSF的作用是使外周血单个核细胞向 DC及巨噬细胞分化，IL-4的作用是抑制巨噬细胞的生成，而TNF-a的作用则是刺激DC成熟［４］。

    在本实验中，我们将外周血单个核细胞先经GM-CSF及IL-4 培养5 d～7 d，大部分细胞悬浮生长，体积增大，有大量毛刺。此时再将人肝癌细胞总RNA电转染DC,使DC摄取外来抗原，同时加入TNF-a则促进DC成熟，增强其抗原呈递能力。我们选择人肝癌细胞总RNA作为转染物，其优势［５］在于①RNA半衰期短，只在宿主细胞的细胞质中表达，不会整合到DNA中，提高了临床应用的安全性；②在体外可通过PCR方法使RNA大量扩增，解决了人肝癌细胞来源量的问题；③RNA可诱导产生针对不同表位的多克隆的CD4＋的辅助性T细胞和CD8+的细胞毒性T细胞的免疫反应。

    在实验中，我们选择了电转染作为转染方式，其特点为：①电转染为一种纯物理方法，因此可避免化学性的和生物性的毒性。②应用范围广，可适用于各种类型的细胞［６～８］。③实验证明，其转染率较高［９～11］。④电转染会对imDC造成一定的损伤，如：细胞融合、细胞死亡等，但是绝大多数细胞可恢复到正常状态。⑤电转染不改变imDC原有蛋白的表达。

    从本实验的结果看，经人肝癌细胞总 RNA电转染的DC，能活化静息的T细胞为效应T细胞，效应T细胞表现出明显的对人肝癌细胞的杀伤活性，而对MG-63无此作用。经PBS电转染的DC刺激的T细胞及未经DC刺激的T细胞均无此作用。说明人肝癌细胞总 RNA电转染 DC在体外能有效地诱导特异性抗人肝癌细胞的免疫应答。

    T细胞特异性杀伤肿瘤细胞的机制为：T细胞通过TCR识别抗原呈递细胞（APC），被其呈递的抗原激活后，可表达产生FasL、TNF-α及分泌穿孔素和颗粒酶B。穿孔素可溶解细胞膜形成小孔道，让颗粒酶B进入靶细胞，颗粒酶B可激活caspase3，由此进入死亡信号的级联反应传导，导致细胞凋亡［１２］。FasL和TNF-α可通过细胞凋亡途径引起细胞死亡。

【】
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