激素暴露对子宫内膜金属基质蛋白酶及其组织抑制物表达的影响

                     作者：霍金平 胡定波 张立坚

【摘要】  　　目的：了解联合激素替代(HRT)对子宫内膜金属基质蛋白酶(MMP)9及其组织抑制物 (TIMP) 1表达的影响，探讨其表达与HRT妇女不规则子宫出血之间的关系。方法：宫腔镜活组织检查提取57例HRT合并不规则子宫出血妇女出血期间和出血停止后3月子宫内膜（A１，A２组），以同期HRT但不合并出血的绝经期妇女20例（B组）和未接受HRT绝经期妇女20例（C组）作对照。免疫组织化学标记观察MMP-9、TIMP-1蛋白质阳性表达及其分布。结果：不规则出血妇女中MMP-9低水平表达，与其他各组之间没有显著性差异，但其阳性细胞更多地分布于蜕膜化的基质细胞浆中。暴露于激素治疗妇女不规则子宫出血发生率显著增高，子宫内膜中TIMP-1表达显著高于未接受HRT的绝经期妇女。HRT伴出血妇女子宫内膜中TIMP-1表达均显著性增加，同一个体在出血期间的TIMP-1表达也显著高于出血停止后3月(χ2=5.643，P=0.003)。接受HRT但从未出现不规则出血妇女子宫内膜TIMP-1表达也明显高于未接受HRT妇女(χ2=4.411，P=0.036)。结论：HRT伴不规则出血妇女子宫内膜TIMP-1表达显著增加，与MMP-9之间平衡破坏，与正常月经出血表达方式完全不同。

【关键词】  激素替代治疗 金属基质蛋白酶 金属基质蛋白酶组织抑制物 不规则子宫出血

　　Abstract  Objective:To determine how hormone replacement therapy(HRT)exposure alters endometrial production of matrix metalloproteinase(MMP)-9 and their tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-1 and to assesse the relationship between MMP-9,TIMP-1 production and irregular uterine bleeding patterns in HRT users.Methods:Endometrial biopsies had been harvested from 57 postmenopausal women taking combined HRT during(group A1)and outside(group A2)irregular bleeding by hysteroscope.A comparative observation was conducted with cohort of 20 postmenopausal women not taking HRT(group B)and 20 postmenopausal women taking HRT but not companied with IUB(group C).Expression and immunolocalization of MMP-9,TIMP-1 had been detected by immunohistochemistry labelling respectively.Results:Tenellous increase of MMP-9 localization had been seen in association with irregular bleeding,but these did not reach statistical significance.However,the most prominent localization of MMP-9 was seen in decidualized stromal cells.Incidence of irregular uterine bleeding was statistically augmented in HRT users.There was a statistically significant relationship between endometrial production of TIMP-1 and irregular bleeding in HRT users and was significantly increased in those with irregular bleeding compared with those with amenorrhea.The most prominent TIMP-1 production were seen in biopsies obtained during a bleeding episode rather than outside bleeding episode(χ２=5.643,P=0.003).There was also a significant trend toward elevated endometrial TIMP-1 production had been noticed in biopsies taken from subjects without a history of irregular bleeding compared with those menopause wemen with no HRT(χ２=4.411,P=0.036).Conclusion:Our observation suggests that the endometrial balance between MMP-9 and TIMP-1 contribute to vascular breakdown with HRT but by a different mechanism than that seen in normal menstruation breakthrough bleeding.
   
　　Key words  Hormone replacement therapy;Matrix metalloproteinase;Tissue inhibitor of metalloproteinase;Irregular uterine bleeding

　　正常卵巢周期伴随子宫内膜复杂变化，月经来潮始发于细胞外基质的降解，月经周期中MMPs/TIMPs在内膜中的表达模式是维持正常月经的关键［１］。有研究证实正常行经期子宫内膜中MMP-9定植于腺泡上皮细胞、表达显著增加，而其组织抑制物（TIMP-1）的表达则受到显著抑制［２］。不规则性子宫出血是序贯性或连续性联合激素替代治疗（HRT）妇女的常见并发症（发生率约为40%［３］），多发生在内膜表层，主要由于血管结构异常、脆性增加，并伴随表层上皮的破坏，类似月经期的机制崩溃。MMPs/TIMPs作为调节基底膜成分沉积和降解的主要系统，其局部表达平衡的改变可能参与异常出血的分子学机制。金属基质蛋白酶（MMPs）及其组织抑制物（TIMPs）被认为很有可能参与调节正常月经周期的出血和孕激素避孕时的穿破性出血。本组临床研究旨在通过对不规则出血妇女子宫内膜MMP-9/TIMP-1的表达改变检测，探讨HRT对妇女子宫内膜MMP-9及其组织抑制物TIMP-1之间平衡的影响，为预防和治疗不规则出血提供临床理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象
   
　　2003年1月～2007年12月，获得伦理委员会及本人知情同意的接受宫腔镜活组织检查接受HRT的绝经期妇女57例，分别在出血期间和出血停止后3个月行宫腔镜活检，设为A1组、A2组。另外选择20例HRT但无出血经历的绝经期妇女（B组）和未接受HRT的绝经期妇女20例（C组）作为对照。入选者均为具有完整子宫的绝经6月以上的妇女［３］，以下病例排除在研究对象之外：①末次月经＜6月；②并发主要器官疾病；③接受HRT＜3月；④阴道超声检查提示子宫内膜息肉、子宫内膜癌或子宫内膜增生≥6 mm者，⑤伦理委员会未批准或本人未签署知情同意书者。

　　1.2  研究设计
   
　　完全配对的随机研究观察A1、A2组MMP-9、TIMP-1表达及其与不规则出血的关系；随机对照研究观察A1组与B、C组间，A2与B、C组间，B组与C组间MMP-9、TIMP-1表达差异及其与出血事件的关系。所有妇女均按事先制定方案先后接受妇科检查、巴氏涂片、阴道超声检查和宫腔镜检查，除外阴道、宫颈病变或宫内节育器导致的出血。志愿者在阴道超声检查当日或次日行宫腔镜检查，同时活检切取子宫内膜组织。

　　1.3  试剂和方法
   
　　阴道超声采用日本生产TOSHIBA325型超声仪，阴道探头频率为6MHz。宫腔镜采用日本OLYMPUS公司生产的外鞘4.5 mm硬管型诊断宫腔镜及膨宫机，膨宫介质为生理盐水，膨宫压力80 mmHg～100 mmHg，膨宫液流量150 mL/min～250 mL/min。抗人MMP-9(SC-6841)、TIMP-1 (SC-5538) 鼠抗人单克隆抗体和相应的β-actin多克隆抗体(SC-1615)购自美国Santa-Cruz公司；SP免疫组织化学购自北京中山生物有限公司。活检组织块切取后立即浸泡于10%福尔马林中，18 h内包埋于石蜡中标准脱水，切成5 μm薄片，1张苏木素-伊红（HE）染色，再按SP试剂盒说明书行免疫组化实验。MMP-9和TIMP-1阳性着色均为细胞浆内棕黄色颗粒，每个标本随机2张切片，每张切片随机5个视野（400×），由2名病理医师分别观察统计阳性细胞数。采用半定量方法描述每张切片MMP-9和TIMP-1表达：视野内无标记阳性细胞或偶见阳性标记细胞者为低水平表达，中等数量或大量阳性标记细胞者为高水平表达，分别统计视野数。

　　1.4  统计学方法
   
　　所有数据均经SPSS13.0软件进行统计分析，组间采用χ2检验，假设检验均采用双侧，P＜0.05为有统计学差异。

　　2  结果

　　2.1  一般情况
   
　　97位妇女年龄为43岁～72岁，平均(59.2±6.7)岁，平均绝经时间(9.12±7.21)年（1岁～28年）；A组（57例）和B组（20组）的77位妇女中序贯性联合HRT妇女63例、连续性HRT妇女14例。A、B、C三组妇女年龄、绝经时间均无显著性差异，具有组间可比性。

　　2.2  病检查
   
　　宫腔镜检查显示三组妇女绝经后子宫腔萎缩，内膜平滑、菲薄，呈淡黄红色，不透明，有时可见到散在的小出血斑点。HE染色提示大多数病例子宫内膜呈现萎缩或增加降低，部分妇女出现非常弱的增殖样改变，子宫内膜间质萎缩、组织断裂导致基质细胞集聚，嗜银网状结构消失，少数妇女表现为蜕膜化或分泌状态。出现子宫内膜蜕膜化改变的妇女集中在接受HRT的妇女中，而那些未接受HRT的妇女则没有类似变化。子宫内膜组织学表现与出血方式或雌激素、孕激素使用方法没有显著性关系，序贯或连续HRT的妇女子宫内膜组织学表现也没有显著性和持续性差别。

　　2.3  免疫组织化学染色
   
　　与非HRT妇女相比，HRT妇女子宫内膜MMP-9表达水平轻度增加，但免疫标记的差异没有显著性（见表1）。HRT没有出血的妇女MMP-9免疫定位局限于表皮细胞和小血管管壁，而HRT妇女伴出血者MMP-9的表达也未见显著性增加。MMP-9广泛分布于出血期间妇女子宫内膜活检的血管、腺体、表皮细胞、基质细胞和粒细胞细胞浆中，突出的表现定位于蜕膜化的基质细胞中并可见蜕膜化活检。子宫内膜MMP-9表达量与HRT患者是否出血并无显著相关。HRT妇女子宫内膜中TIMP-1的表达量与不规则出血有显著相关性。HRT伴有出血的妇女内膜中TIMP-1免疫标定位高水平表达妇女的百分率与HRT却不伴出血妇女有显著性差异(A1组-B组：χ2=19.362，P=0.000；A2组-B组：χ2=4.820，P=0.028)；与未接受HRT的绝经期妇女比较表达量增加也有统计学意义（A1组-C组：χ2=48.999，P=0.000A1；A2组-C组：χ2=22.779，P=0.000）。

　　表1  各组子宫内膜MMP-9、TIMP-1表达情况（略）

　　各组子宫内膜间MMP-9高水平表达无显著性差异，均有P>0.05,各组子宫内膜间比较均有P<0.05。
       
　　突出的是，在配对观察中与出血停止3月后的同一个体活检组织TIMP-1表达量相比较，出血期间HRT妇女子宫内膜中TIMP-1表达量显著增加，高水平表达的病例视野数显著高于前者（A1组-A2组：χ2=5.643，P=0.003）；而在那些从未有不规则出血经历的HRT妇女TIMP-1表达也明显高于从未接受HRT的妇女 (B组-C组：χ2=4.411，P=0.036)。

　　3  讨论
       
　　月经期间子宫内膜细胞外基质成分和基底膜广泛降解，组织皱缩、胶原消失导致毛细血管暴露和血管破口，MMPs/TIMPs时调节子宫内膜基质崩溃和修复的平衡系统，在子宫内膜月经周期的不同时间有不同的表达，并特异性地发挥各自作用，在月经发动、内膜修复和血管生成中调节内膜基质的代谢。妇女行经期子宫内膜MMPs表达显著增加、活性增强，而TIMPs则被温和地抑制，子宫内膜启动血管崩塌、出血和重塑［４］。TIMP-1被认为是一种可诱导的组织蛋白酶抑制体［５］定位于一种具有中性粒细胞组织学表现的基质细胞细胞浆中，而在表皮细胞中并不常见。TIMP-1在子宫内膜发挥大量重要的调节作用，TIMP-1与MMP-9形成1∶1特异性复合物并抑制后者活性，TIMP-1也受生长因子和细胞因子在转录水平上调节，并可能抑制内皮细胞生长，而这些作用并不依赖MMP-9。TIMP-1在导致不规则出血的一个作用可能是在出血期间和最近出血的个体间表达增加。
       
　　激素替代疗法（HRT）是缓解围绝经期妇女一些病症的常用方法，被越来越多的妇女认可，但其引起的不规则出血影响了依从性。曾经有不规则出血和那些正在出血期间妇女的子宫内膜活检均出现子宫内膜萎缩［６］，局部组织崩塌，血管壁僵硬断裂、间质出血和表皮腐败塌陷。我们曾预期希望发现类似正常性经期子宫内膜类似的MMP-9表达增加而TIMP-1表达降低，然而，研究观察到接受HRT者其子宫内膜MMP-9表达低于同年龄未接受HRT者，MMP-9/TIMP-1比值随接受HRT时间延长而逐渐降低，由1年时的1.4降至3年时的1.0，与门诊观察到接受HRT初期不规则出血发生率很高而后逐年下降是一致的［７］。我们观察到类似却更加明显MMP-9/TIMP-1平衡破坏，MMP-9表达受到温和抑制而TIMP-1表达量显著增加。尽管差异没有显著性，但与非HRT妇女比较，HRT妇女子宫内膜MMP-9表达水平还是可以观察到轻度增加。有意义的是，HRT妇女伴出血者MMP-9的表达广泛分布于出血期间妇女子宫内膜活检的血管、腺体、表皮细胞、基质细胞和粒细胞细胞浆中，突出的表现定位于蜕膜化的基质细胞中并可见蜕膜化活检。HRT妇女无论是否有不规则出血经历、或是否正处在出血期间，MMP-9组织抑制物TIMP-1的表达量显著高于非HRT妇女；而有出血经历的HRT妇女，子宫内膜TIMP-1免疫标定位高水平百分率显著高于无出血经历的HRT妇女；同一个体出血期间和出血停止后3个月的配对观察中，前者显著高于后者。观察提示HRT相关的TIMP-1表达增加，TIMP-1与不规则出血相关并且在出血期间显著表达增加。增加的TIMP-1表达很可能是一种反应而不是出血的原因，可能系中性粒细胞在血管损害或增加通透性所致。
       
　　总之，我们发现联合HRT伴发不规则子宫出血妇女的子宫内膜TIMP-1表达显著增加，并且MMP9低水平表达。提示HRT出血妇女内膜环境与正常月经期突破性出血患者有显著差异。认识到这种差异是有效预防或处理HRT不规则出血的重要步骤。

【】
  　　［１］ Curry TE Jr,Osleen KG.Cyclic shanges in the matrix metalloproteinase system in the ovary and uterus.Biol Reprod,2001,64:1　285～1　296.

　　［２］ 周赞华,黄丽丽.基质金属蛋白酶系统与子宫内膜.国外医学.妇产分册,2005,32:290～293.

　　［３］ MacLennan A,Lester S,Moore V,et al.Oral estrogen replacement therapy versus placebo for hot flushes:a systematic review.Climacteric,2001,4:58～57.

　　［４］ 方爱华,赵右更.绝经后妇女激素替代:子宫内膜增生和不规则出血.生殖与避孕,2006,10:618～626.

　　［５］ Sato T,Koike L,Miyata Y,et al.Inhibition of activator protein-1 binding activity and phosphatidylinositol 3-kinase pathway by nobiletin,a polymethoxy flavonoid,results in augmentation of tissue inhibitor of metalloproteinases-1 production and suppression of production of matrix metalloproteinases-1 and -9 in human fibrosarcoma HT-1080 cells.Cancer Res,2002,62:1　025～1　029.

　　［６］ Chegini N,Rhoton-Vlasak A,Williams RS,et al.Expression of matrix metalloproteinase-26 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3-and 4- in endometrium throughout implants who experience irregular uterine bleeding.Fertil Steril,2003,9:564～570.

　　［７］ 魏 杨,薛加强.绝经后应用激素替代治疗妇女的子宫内膜细胞形态观察.中华妇产科杂志,1997,7:432～435.