络泰对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】  目的：观察络泰对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其可能机制。方法：将大鼠随机分成六组：假手术组、模型组、络泰5 mg/kg组、50 mg/kg组、100 mg/kg组和阳性对照复方丹参注射液组，应用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO），观察缺血2 h再灌注24 h后络泰对大鼠行为、脑梗死面积、脑含水量的影响，用放免法测定血浆中TXB2(血栓素B２)和 6-Keto-PGF1α(6-酮-前列腺素F1α)的水平。结果：络泰50 mg/kg组、100 mg/kg组能明显改善MCAO大鼠行为障碍、脑梗死范围、脑含水量。大鼠血浆的TXB2含量及TXB2/6-Keto-PGF1α (T/P)值较模型组明显降低(P<0.05)，6-Keto-PGF1α含量显著增高(P<0.05)。结论：络泰能通过降低血栓素A2（TXA2），升高PGI2，使TXA2/PGI2比值降低，达到对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。

【关键词】  络泰 局灶性脑缺血 缺血再灌注损伤 TXB2 6-Keto-PGF1α

    Abstract  Objective：To investigate the protective effects and mechanism of Luotai against local cerebral ischemia and reperfusion injury in rats. Methods：Wistar rats were divided into 6 groups randomly. They are treated with Luotai at the dose of 5 mg/kg,50 mg/kg,100 mg/kg,Danshen（100 mg/kg）and normal saline injection respectively. Models of local cerebral ischemia/reperfusion were prepared with middle cerebral artery occlusion (MCAO). The neurologyic status of each rat, the infarction area of brain tissue and the water content were measured after 2 hour of occlusion followed by 24 hour reperfusion. We observed the effect of Luotai on TXB2 and 6-Keto-PGF1α by radioimmunoassay. Resluts：Luotai (50 mg/kg, 100 mg/kg) markedly improve the neurologyic status and decrease the cerebral infarction, the water content of brain. Luotai(50 mg/kg,100 mg/kg) could increase the generation of 6-Keto-PGF1α and decrease the level of TXB2 and TXB2/6-Keto-PGF1α(T/P) in blood plasma.Conclusion：Luotai has protective effect on local cerebral ischemia/reperfusion injury in rats by increasing the generation of 6-Keto-PGF1α,decreasing the level of TXB2 and improving the balance of TXA2/PGI2 in blood plasma.

    Key words  Luotai injection；Local cerebral ischemia；Cerebral ischemia and reperfusion；TXB2；6-Keto-PGF1α

    络泰是三七总皂苷冻干粉针剂。三七总皂苷具有活血祛瘀、通脉活络、降压、抗心律失常等作用。常用于中风偏瘫、瘀血阻络及脑血管疾病后遗症、胸痹心痛、视网膜中央静脉阻塞属瘀血阻滞证者。本实验通过线栓大脑中动脉法制备大鼠脑局灶缺血再灌注模型，观察络泰对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，通过检测血浆中PGI2的稳定代谢产物6-Keto-PGF1α和TXA2的稳定代谢产物TXB2水平，探讨其作用机制，为临床用药提供一定的依据。

    1  材料与方法

    1.1  动物

    健康Wistar大鼠，体重(220±20) g，雌雄兼用(由山西医科大学实验动物中心提供)。

    1.2  药品及试剂

    络泰粉针剂(昆明制药股份有限公司，批号：050520)，用络泰溶剂溶解，再用生理盐水稀释后备用。复方丹参注射液(黄山市天目药业有限公司，批号：050601)。TXB2、6-Keto-PGF1α放免测定试剂盒(北京东亚免疫技术研究所，批号：060113)。

    1.3  方法

    1.3.1  分组：大鼠随机分为六组，分别为①络泰小剂量组(5 mg/kg)，②络泰中剂量组 (50 mg/kg)，③络泰大剂量组(100 mg/kg)，④复方丹参组(100 mg/kg)，⑤模型组，⑥假手术组。络泰组、复方丹参组预先连续尾静脉注射给药，每天1次，连续5 d，再灌注6 h、12 h时再给药两次。模型组和假手术组大鼠注射生理盐水，给药时间及体积同前。

    1.3.2  大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立：参照Longa等［１］的方法并加以改进制备左侧大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。颈正中做约1.5 cm皮肤切口，暴露左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）及颈内动脉（internal carotid artery，ICA），结扎ECA，将头端用石蜡包被的尼龙鱼线通过CCA切口处插入ICA，插线长度自CCA分叉处约18 mm～20 mm（根据动物体重而定），然后缝合皮肤，栓线尾端部分固定于皮肤上。于缺血2  h后，抽出尼龙鱼线予以再灌注24 h。假手术组大鼠只分离出CCA、ECA和ICA，不结扎任何动脉及插线。

    1.3.3  神经行为缺陷评分：标准如下：0分：无神经功能缺失症状；1分：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2分：推瘫痪侧时感阻力较对侧明显降低；3分：大鼠爬行时向瘫痪侧旋转；4分：伴有意识障碍。

    1.3.4  脑梗死范围测定：在缺血2 h再灌注24 h后，每组取8只动物，断头取脑，剔除嗅脑、低位脑干及小脑，称重后置于-20 ℃低温冰箱快速冷冻30 min后，将脑组织做冠状切片，厚度约为2 mm。脑片置于1% TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min。待显色完全后置50％甲醛溶液中固定24 h。仔细分离苍白区和非苍白区，分别称重，梗死区脑质量占全脑质量的百分比作为梗死范围。

    1.3.5  脑组织含水量的测定［２］：       参照Hallenbeck法，每组取8只动物，切取大脑前极到视交叉处的脑片，分别称量左脑片湿重；105 ℃烘干至恒重，即干重。按下列公式计算脑含水量，脑含水量(％)=［脑湿重(g)-脑干重(g)］/脑湿重(g)×100％。

    1.3.6.  血浆中6-Keto-PGF1α和TXB2的测定：断头取脑同时取血3 mL于EDTA抗凝离心管中，混匀，4 ℃离心3 500 r/min，15 min，分离血浆，放于-20 ℃保存，而后按放免试剂盒说明，自动γ计数器预先编程，直接测出样品浓度。

    2  结果

    2.1  对大鼠行为障碍的影响

    局灶性脑缺血2 h再灌注24 h后，除假手术组外，所有动物出现不同程度的神经运动功能障碍，模型组尤为明显，主要表现为跛行和手术对侧瘫痪。经络泰及复方丹参注射液后脑缺血大鼠的行为障碍有不同程度的改善，结果见表1。

    2.2  对大鼠脑梗死范围的影响

    假手术组大鼠脑组织呈均匀一致的玫瑰红色，无缺血梗死灶，其他各组大鼠大脑皮质均出现明显苍白色的梗死灶，与模型组相比，复方丹参注射液及络泰50 mg/kg、100 mg/kg剂量组可明显缩小局灶性脑缺血大鼠的脑梗死面积，结果见表1。

    2.3  对大鼠脑组织含水量的影响

    与假手术组相比，其他各组病灶侧半球含水量明显增加，复方丹参注射液及络泰50 mg/kg、100 mg/kg剂量组脑水肿程度较模型组明显降低，结果见表1。表1  络泰对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠行为缺陷程度、脑梗死范围、脑组织含水量的影响与模型组相比，*P<0.05，** P<0.01

    2.4.  血浆中6-Keto-PGF1α和TXB2的水平

    与假手术组相比，脑缺血再灌注模型组大鼠血浆中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α(T/P)值明显升高。与模型组比较，络泰50 mg/kg、100 mg/kg剂量组和复方丹参注射液组TXB2及T/P值均明显降低，而6-Keto-PGF1α则明显高于模型对照组。表2  络泰对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠血浆TXB2和6-Keto-PGF1α水平及T/P比值的影响与假手术组相比，# P<0.05，## P<0.01；与模型组相比，* P<0.05，** P<0.01

    3  讨论

    在急性脑血管病中，缺血性脑血管疾病占50％～70％，近年来发现发病后48 h内，绝大多数病人的缺血皮质已发生了再灌注。众所周知，脑缺血后的再灌注是神经功能恢复的基本条件，也是脑组织损伤加重的重要因素。三七乃活血化瘀之良药，研究证实其有抗自由基、降低血黏度、抗血小板聚集、扩张血管、降低血脂、改善微循环和抑制血栓形成及抗炎等作用［３］。本研究应用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型来观察络泰对脑缺血再灌注损伤的保护作用，结果络泰能明显降低脑水肿、缩小梗死面积和改善运动功能，显示出良好的脑缺血保护作用。这与报道三七皂苷能减轻钙超载、脑水肿、超微结构的损伤，促进再灌注时的神经修复和降低缺血再灌注期间死亡率等结果相一致［4～5］。

    目前，脑缺血再灌注损伤的病理生理是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应，其中血栓素与前列腺素系统失衡是其发生的机制之一。PGI2和TXA2均为花生四烯酸的代谢产物，在正常情况下，PGI2和TXA2保持着动态平衡以维持对血管及供血的调节，而病理状态下花生四烯酸代谢异常，导致PGI2和TXA2的比例失调，血小板合成TXA2增多，血管内皮细胞生成PGI2受抑制，血小板呈现高凝状态，微血管收缩性增强等，导致低灌流，加重缺血组织的损伤。由于PGI2和TXA2性质不稳定难以直接测定，故测定PGI2的稳定代谢产物6-Keto-PGF1α和TXA2的稳定谢产物TXB2作为判断PGI2和TXA2水平的指标。本实验表明大鼠缺血/再灌注后大鼠血浆中TXB2及T/P值明显升高(P<0.01)，而络泰中高剂量组能抑制脑缺血再灌注模型大鼠血浆中TXB2的生成，同时增加6-Keto-PGF1α在血浆中的含量，使T/P比值降低，故我们认为络泰有良好的脑缺血保护作用，降低TXA2合成，升高PGI2，降低T/P比值是其对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用机制之一。

【文献】
  ［１］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats．Stroke，1989，20(1)：84.

［２］ 丁永芳，袁冬萍，方泰惠，等．注射用银杏叶(冻干)对实验性脑缺血的保护作用．时珍国医国药，2003，14(4)：201．

［３］ 贾 乘，张 林，程嘉艺．三七抑制大鼠血栓形成实验研究．中医药学刊，2001，19(2)：172．

［４］ 刘宗超，吴官恩，赵克建，等．三七三醇皂苷对大鼠缺血/再灌注脑损伤保护作用的研究．中风与神经疾病杂志，2007，24 (1)：38．

［５］ 胡晓松，周德明．三七三醇皂苷对脑缺血再灌注大鼠的保护作用．中风与神经疾病杂志，2004，21 (4)：354．