阿托伐他汀对AngⅡ诱导内皮细胞VCAM-1和 ICAM-1 mRNA表达的影响

【摘要】  目的：观察阿托伐他汀对于血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的培养人脐静脉内皮细胞表达血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）mRNA的影响，探讨阿托伐他汀的非降脂作用和潜在的作用。方法：培养人脐静脉内皮细胞，取生长良好的第2、3代细胞进行实验。将细胞分为三组：对照组、AngⅡ组、阿托伐他汀干预组。对照组加培养液，AngⅡ组以不同浓度的AngⅡ与细胞共孵育24 h，干预组首先用不同浓度的阿托伐他汀（0.05 μmol/L,0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10 μmol/L）分别作用1 h，而后加1 μmol/L AngⅡ与细胞共育24 h。半定量RT-PCR测定粘附分子ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达。结果：AngⅡ能上调ICAM-1 和 VCAM-1的表达，阿托伐他汀在一定程度上可抑制上述作用。结论：阿托伐他汀可抑制粘附分子ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达，可能具有增加粥样斑块稳定性和延缓动脉粥样硬化进程的作用。

【关键词】  动脉粥样硬化 血管紧张素 VCAM-1 ICAM-1 阿托伐他汀

    Abstract  Objective：To observe the influence of atorvastatin on the mRNA expression of vascular cell adhesion  molecule-1 (VCAM-1）and intercellular  adhesion molecules-1 (ICAM-1) in cultured human umbilical  artery endothelial cells (HUVEC) induced by AngⅡ in order to understand the non-lower lipid of atorvastatin. Methods:There were three groups:control,AngⅡ,atorvastatin group. Cells of AngⅡ were coincubated  with 0.01 μmol/L～10 μmol/L AngⅡ for 24 h.Cells of atorvastatin were cultured with 0.05 μmol/L,0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10 μmol/L atorvastatin for 1h, then coincubated with AngⅡ(1 μmol/L) for 24 h.VCAM-1 and ICAM-1 mRNA were detected by RT-PCR.Results:The increase of VCAM-1and ICAM-1 mRNA expression induced by AngⅡ were inhibited by atorvastatin.Conclusion: Atorvastatin may increase the stability of plaques and decelerate the progression of atherosclerosis through inhibiting the mRNA  expression of VCAM-1 and ICAM-1.

    Key words  Atherosclerosis; AngⅡ; VCAM-1；ICAM-1;Atorvastatin

    动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)发病过程十分复杂，其确切病因和发病机制尚未完全阐明。随着对As病变研究的不断深入，越来越多炎症相关因子的相继发现，As的炎症学说被普遍接受［１，２］。肾素-血管紧张素系统(RAS)是重要的体液调节系统，对血压和机体内环境的稳定起重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是该系统的重要生物活性肽，它通过受体介导途径，产生如收缩血管、增加心肌收缩力、促细胞增殖、水钠潴留等目前己经广为人知的生物学效应。近年来，AngⅡ在炎症方面的作用越来越受到大家重视，成为研究热点。最新表明，AngⅡ可通过AT1受体激活p38MAPK通路，启动核转录因子NF-κB进而产生P选择素、E选择素、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemo-attractant  protein-1，MCP-1)、细胞间粘附分子-1（intercellular  adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)，促进单核细胞与内皮细胞粘附、浸润，介导炎症反应，参与AS形成［３～8］。

    他汀类药物的降脂作用、斑块稳定作用等已被学者所逐渐认识，而其非降脂依赖性的抗炎作用近年来才成为心血管领域的研究热点。大量的研究集中在他汀类药物通过减少病灶中巨噬细胞数量、抑制MMP基因转录、抑制核因子κB活性等机制下调MMP、TF及IL-6等多种细胞因子的表达上。对内皮细胞的研究较少，多集中在内皮功能如NOS等方面，对AngⅡ所诱导内皮细胞中粘附分子表达的影响目前研究较少。为此,我们探讨了阿托伐他汀对AngⅡ诱导HUVEC ICAM-1和VCAM-1基因水平的表达。

    1  材料与方法

    1.1  材料与试剂

    健康新生儿脐带由山西医科大学第一妇产科提供；AngⅡ为美国Sigma公司产品；vWF免疫组化试剂盒 、山羊SP试剂盒 、DAB显色剂均购自北京中山生物技术有限公司；RPMI 1640培养基、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶（Gibco公司）；RT-PCR试剂盒、引物（大连宝生物有限公司）；PCR Mark、胎牛血清（上海生物工程技术有限公司）；Ⅷ因子相关抗原（北京中山生物试剂公司）；Trizol（杭州四季青）；阿托伐他汀原粉由辉瑞公司惠赠；ICAM-1、VCAM-1试剂盒购自上海雄森公司。

    1.2  方法

    1.2.1  原代人脐静脉内皮细胞培养、鉴定与分组：无菌取分娩4 h健康新生儿脐带，用PBS缓冲液冲洗，以0.1% Ⅱ型胶原酶37 ℃消化，终止消化后收集消化液离心，弃上清液。加入RPMI 1640培养基，在5% CO2、37　℃培养箱内培养。待细胞生长达亚融合状态时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代。选择生长良好的第2-5代细胞用于实验。采用形态学及抗Ⅷ因子抗体免疫荧光染色行内皮细胞鉴定。

    培养的细胞分为三大组：①对照组：不加干预因素；②AngⅡ组：不同剂量的AngⅡ（0.01 μmol～10 μmol/L）培养细胞24 h；③AngⅡ+阿托伐他汀组：用不同浓度的阿托伐他汀（0.05 μmol/L，0.1 μmol/L，1.0 μmol/L，10 μmol/L）分别作用1 h，而后加1 μmol/L AngⅡ与细胞共育24 h。

    1.2.2  MTT检测细胞活性：将传代的进入对数生长期细胞按一定密度(5×104/mL)接种在96孔培养板中，待细胞贴壁生长融合至80%时，弃去培养液，分别加入上述各组干预因素，培养24 h后去上清，加入5% MTT染料溶液25 μL，放入培养箱内继续培养4 h，取出培养板。弃去上清液，加入二甲基亚砜100 μL，温室内放置30 min，待蓝色结晶充分溶解后，在490 nm下的酶标仪上读取OD值，记录结果。

    1.2.3  RT-PCR检测：收集上述各组细胞，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA。取各组细胞总RNA 1 μg逆转录合成cDNA，再取逆转录产物10 μL进行PCR循环。PCR引物及扩增片段为VCAM-1的引物序列为：上游：5′-GATACAACCGTCTTGGTCAGCCC-3′；下游：5′-CGCATCCTTCAACTGGGCCTT-3′，共490 bp；ICAM-1的引物序列为：上游：5′-CAGTGACCATCTACAGCTTTCCGG-3′；下游5′-GCTGCTACCACAGTGATGATGACAA-3′，共450 bp；GAPDH的引物序列参照［9］：上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，共650 bp。反应结束后，取反应产物10 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，UVP型凝胶图像分析系统摄图，并分析各组目的基因及GAPDH基因灰度值，以两者的比值代表各基因的表达量。

    1.3  统计学处理

    所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS11.5统计软件对实验数据进行ANOVA单因素方差分析，多重比较采用LSD和SNK法。P＜0.05具有统计学意义。

    2  结果

    2.1  人脐静脉内皮细胞的分离与鉴定

    从人脐静脉上分离下来的内皮细胞起初呈圆形或椭圆形，多呈小团存在，4 h细胞开始贴壁，之后很快生长成为多数单层小多角型集落，培养2 d～3 d后，细胞生长迅速，集落增大，3 d～5 d开始融合形成排列紧密的单层细胞。细胞呈鹅卵石样镶嵌排列，无重叠生长现象，细胞多呈多角形；传代培养的人脐静脉内皮细胞体积增大，胞浆丰满，梭形或多角形，细胞排列稍稀疏。随着传代次数的增多，则可见多个双核细胞，表明细胞分裂旺盛。

    内皮细胞膜表面的Ⅷ因子相关抗原为其特有的抗原。用Ⅷ因子相关抗原的特异性单克隆抗体荧光免疫组化染色法，可检测到培养的人脐静脉内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原为阳性。在荧光显微镜下扫描，人脐静脉内皮细胞核周胞浆呈较强黄绿色荧光，呈颗粒状存在或弥散分布，而背景无荧光显示。表明Ⅷ因子相关抗原存在，所分离培养的细胞为血管内皮细胞。从而在实验材料上确保实验结果的可靠性。

    2.2  细胞毒性试验

    MTT(四甲基偶氮唑盐)是显示线粒体脱氢酶的试剂,MTT能被活的细胞吸收,通过组织化学反应可产生不溶性的针状Formazan蓝色结晶（见图1～图3）,在定量细胞活性上有应用价值。结果显示低于100 μmol/L 浓度的AngⅡ、阿托伐他汀对HUVEC生长无任何毒性,细胞存活率达96.0%以上;高于100 μmol/L 造成的细胞死亡率分别是17.0%和21.6%。

    2.3.  不同浓度AngⅡ对内皮细胞表达VCAM-1、ICAM-1 mRNA的影响

    将不同浓度AngⅡ加入内皮细胞培养24 h，以GAPDH为内参照，结果发现：对照组几乎没有ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达，0.01 μmol/L AngⅡ使ICAM-1和VCAM-1的mRNA的表达均开始增加（P<0.05），1 μmol/L的AngⅡ使其表达达到最高峰（P<0.01），而后开始下降（见表1、表2，图1、图2)。表1  不同浓度(μmol/L)AngⅡ对内皮细胞表达VCAM-1 mRNA的影响 与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01表2  不同浓度(μmol/L)AngⅡ对内皮细胞表达ICAM-1 mRNA的影响  与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01

    2.4.  不同浓度的阿托伐他汀对培养内皮细胞表达ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA的影响

    AngⅡ组和阿托伐他汀干预组（0.05 μmol/L,0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10 μmol/L）ICAM-1 mRNA和对照组ICAM-1 mRNA之间比较有显著差异，但阿托伐他汀干预组(10 μmol/L,1.0 μmol/L,0.1 μmol/L) ICAM-1 mRNA较AngⅡ组明显下降(P<0.05)，而阿托伐他汀干预组（0.05 μmol/L ）和AngⅡ组之间ICAM-1 mRNA比较，无统计学意义(P>0.05)。（见表2、表4，图2、图4)。

    AngⅡ组和阿托伐他汀干预组（0.05 μmol/L,0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10 μmol/L）VCAM-1 mRNA和对照组VCAM-1 mRNA之间比较有显著差异，但阿托伐他汀干预组(10 μmol/L,1.0 μmol/L,0.1 μmol/L)VCAM-1 mRNA较AngⅡ组明显下降(P<0.05)，而阿托伐他汀干预组（0.05 μmol/L ）和AngⅡ组之间VCAM-1 mRNA比较，无统计学意义(P>0.05)。（见表1、表3，图1、图3）表3  不同浓度（μmol/L）的阿托伐他汀对内皮细胞表达VCAM-1 mRNA的影响表4  不同浓度（μmol/L）的阿托伐他汀对内皮细胞表达ICAM-1 mRNA的影响  对照组相比*P＜0.05，#与AngⅡ组相比P＜0.01

    3  讨论

    近年的研究表明许多致动脉粥样硬化(As)的危险因素均可损伤血管内皮细胞，促进粘附分子的表达，使循环中的单核细胞与内皮细胞粘附，继而在MCP-1的作用下，使单核细胞与淋巴细胞在内膜下聚集，产生一系列炎症、免疫反应，从而促进As的形成。实验证明，AngⅡ通过多种效应参与动脉粥样硬化的发生、。本文的研究发现，AngⅡ与内皮细胞孵育24 h后，粘附分子明显增加，其中以10 μmol/L的AngⅡ刺激ICAM-1的表达量最多。Pueyo将AngⅡ与大鼠的血管内皮细胞孵育，亦发现AngⅡ具有刺激VCAM-1升高的作用［８，10］，这与国内外报道相一致。从而进一步导致内皮细胞功能失调，促进白细胞与内皮细胞之间的异常粘附和迁移。

    本研究结果发现，阿托伐他汀处理过的内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达较对照组显著下降，说明阿托伐他汀对血管内皮细胞表达ICAM-1和VCAM-1 mRNA有抑制作用。而且本实验进一步观察到，10 μmol/L阿托伐他汀抑制作用强于1 μmol/L和0.1 μmol/L的抑制作用，即随着阿托伐他汀浓度的增加，其对ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达的抑制作用也逐渐增强。但是，也有实验结论与上述结论相反，Bernot D［１1］等也用TNF-α刺激脐静脉内皮细胞表达E-sel与ICAM-1，发现与单用TNF-α相比，阿托伐他汀与TNF-α共同孵育的内皮细胞所表达的ICAM-1和E-sel mRNA量明显升高，但同时他们认为，虽然粘附分子在内皮细胞表面的表达增高，但其可通过改变粘附分子在内皮细胞表面的分布来减少细胞间的粘附。迄今为止，有关他汀类药物影响血管内皮细胞粘附分子表达的研究结果是多样的，还需更多的研究进一步明确。

    本研究发现，阿托伐他汀抑制内皮细胞表达ICAM-1和VCAM-1 mRNA，说明阿托伐他汀是在基因水平起作用的。有人推测，可能是通过对转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARr)［9］、NF-kB［１２］活性的调节实现的，但确切机制不清，有待进一步的研究证实。他汀类药物抑制VCAM-1和ICAM-1表达可以调节炎症反应，既而抑制血栓形成和稳定斑块，这种调脂外抗动脉粥样硬化机制正日益受到重视，国内外心血管专家称:“他汀”类药物的出现，开始了心血管疾病的新纪元。

【】
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