P6BMP2的克隆及其在大肠杆菌中的表达
【摘要】 目的：在大肠杆菌中克隆和表达骨形态发生蛋白2（BMP2）的变体P6BMP2并初步纯化。方法：根据P6肽的氨基酸序列，按照大肠杆菌偏爱密码子将P6肽的核酸序列设计在5′端引物，通过PCR方法合成P6BMP2基因，并将其克隆到大肠杆菌表达质粒pALEX中，经NcoⅠ、XhoⅠ双酶切和DNA序列测定验证。结果：通过双酶切和DNA序列分析，证实获得的基因片段与我们期望的相符合，重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析纯化，获得重组蛋白。结论：构建了P6BMP2的表达质粒，获得P6BMP2的表达并建立了纯化方式，为P6BMP2的深入研究和应用奠定了坚实的基础。
【关键词】 骨形态发生蛋白;P6;P6BMP2;大肠杆菌;胶原蛋白;表达
自1965年Urist[1]发现骨基质中含有能够诱导异位成骨的骨形态发生蛋白(bone morphogenefic protein，BMP)以来，研究者们经过大量动物实验和临床应用研究证实，BMP能在非骨组织如肌肉中诱导形成软骨和骨，是一种高效的骨诱导蛋白，其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导骨形成的因子[2]。由于越来越多的实验证实了BMP2在诱导骨形成和骨修复方面的高效性及安全性，人们开始将其应用于骨科临床，并得到了令人满意的疗效[3?6]。另一方面,在骨缺损的修复重建过程中，成骨细胞产生的Ⅰ型胶原具有特定的引导骨组织修复再生的生物学特性，在促进成骨细胞的粘附、增殖和分化同时，对破骨细胞的吸收也有一定作用。这些功能据推测与其分子结构中含有特定的细胞识别信号有关[7]，Bhatnagar等[8?9]发现在Ⅰ型胶原α链中含有有效细胞结合位点，为一段15个氨基酸序列的细胞结合肽，其与ABM(无机骨粒)相结合可模拟骨细胞外基质成分，促进骨再生。Bhatnagar[10]以此为基础,发明了一组用来模拟Ⅰ型胶原蛋白细胞连接域的肽段,?Ile?Ala?是其核心序列，呈现β弯曲构象。P6肽是其中的一种,其序列是Gln?Gly?Ile?Ala?Gly?Gln。周炳荣等[11]的研究显示，P6肽能够刺激人骨髓间充质干细胞的增殖；杨旭东等[12]则将P6肽和无机骨粒复合用来骨缺损，结果显示该复合物具有较强的促进骨缺损修复能力。这些都表明P6肽具有一定的促进间充质干细胞增殖，加快骨组织修复和再生的能力。为了将BMP2和胶原蛋白在引导骨组织修复或再生中的功能结合起来,我们构建了P6BMP2融合蛋白，希望这个融合蛋白可以提高骨形成能力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 E.coli克隆菌株Top 10和表达菌株BL21(DE3) 均由本实验室保存。
1.1.2 基因和质粒 pALEX和pCI?BMP2由本实验室保存。
1.1.3 酶及化学试剂 各类限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Taq聚合酶等购自Takara公司；RNasin购自Promega公司；引物片断由上海博彩生物公司合成；柱离心胶回收试剂盒购自华舜公司；Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow购自Phamarcia公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA提取、DNA酶切及连接转化 参见[13]方法。
1.2.2 pALEX/P6BMP2质粒构建 P6BMP2序列PCR产物经TBE?agarose回收特异片段，溶解于TE溶液中，取适量进行NcoⅠ、XhoⅠ双酶切。质粒pALEX进行NcoⅠ、XhoⅠ双酶切，分别对酶切的378bp 左右的P6BMP2片段和pALEX质粒片段进行柱离心式胶回收，T4DNA连接酶连接，转化E.coli Top10菌株，酶切及PCR法筛选阳性克隆，得到质粒pALEX/P6BMP2。测序验证序列正确，测序引物为T7 terminator 公用引物，引物序列如下（划线处为限制性酶切位点，方框处为P6肽编码区）：P6BMP2 PCR上游引物（P6BMP2 forward）为5′?CGTTCCCATGGGACAGGGTATCGCTGGTCAGCAAGCCAAACACAAACA GCGG?3′；P6BMP2 PCR 下游引物（BMP2 down）为5′?CAAGCCTCGAGTTAGCGACACCCACAACCCTC?3′。
1.2.3 质粒DNA序列的测定 由上海博彩生物公司完成。
1.2.4 pALEX/P6BMP2质粒表达以及产物的检验 质粒转化BL21（DE3）表达宿主菌后，挑取单克隆于37℃振荡培养过夜，将过夜菌以1∶100的体积接种于新的LB培养液中，37℃培养2h至OD600 nm约为0.6，加入IPTG至终浓度0.5mmol·L-1，30℃诱导表达3h，收集菌体,用15%的SDS?PAGE进行分析。
1.2.5 蛋白质大量表达及纯化 挑取单克隆表达菌株培养过夜，第2天取10ml接种于1L LB培养基中，培养并诱导表达3h后收集菌体，用缓冲液A（50mmol·L-1 Tris，150mmol·L-1 NaCl，pH8.0）重悬菌体，超声破碎后将上清上样于Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow亲和柱，用缓冲液A洗至基线后进行梯度洗脱（20mmol·L-1 Tris,pH8.0,4mol·L-1 尿素到20mmol·L-1 Tris,pH8.0,4mol·L-1 尿素，1mol·L-1 NaCl），收集洗脱峰，最后将洗脱峰脱盐脱尿素得到P6BMP2样品。
2 结 果
2.1 PCR获得P6BMP2基因根据已知的人BMP2基因序列，我们设计的5′端引物增加了NcoⅠ位点，并在BMP2编码区的N端增加了一个P6肽的编码区，于3′端引物终止密码子前增加了XhoⅠ位点。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，所得条带与378bp的理论值一致。见图1。 1.PCR产物；2.分子质量标准DL2000，从上到下依次是2000、1 000、 750、500和250bp
2.2 pALEX/P6BMP2质粒的构建利用T4 DNA连接酶连接分别经NcoⅠ和XhoⅠ消化的P6BMP2基因片断与pALEX载体，连接产物转入E.coli Top10克隆菌株，经双酶切鉴定得到含pALEX/P6BMP2的阳性克隆(图2)，对重组质粒pALEX/P6BMP2进行核苷酸序列分析表明，在重组质粒的T7启动子下游插入DNA片断与预期的完全一致。图3为重组表达质粒pALEX/P6BMP2,P6BMP2编码的氨基酸序列如下（方框内为P6肽的氨基酸序列）：MGQGIAGQQA KHKQRKRLKS SCKRHPLYVD FSDVGWNDWI VAPPGYHAFY CHGECPFPLA DHLNS TNHAI VQTLVNSVNS KIPKACCVPT ELSAISMLYL DENEKVVLKN YQDMVVEGCG CR。1.分子质量标准DL2000，从上到下依次
2.3 P6BMP2的表达及纯化含有表达质粒pALEX/P6BMP2的BL21(DE3)表达菌株经诱导，收集菌体进行15%的SDS?PAGE分析(图4)，在相对分子质量为14000附近出现了表达条带，其分子质量与P6BMP2的理论分子质量相符合。表达产物经纯化后得到纯的P6BMP2（图5）。1.表达菌总蛋白；2.裂解上清；3.细菌裂解沉淀
3 讨 论
骨形成蛋白是转化生长因子β超家族的成员，属于二硫键交联的生长和分化因子。它是一类具有多种功能的细胞因子家族，一方面，BMP是一种能诱导未分化间充质细胞向骨和软骨发生不可逆转化的蛋白质；另一方面，BMP不仅可以促进骨和软骨组织的形成，而且在中胚层诱导、肢体发育、牙齿发育、造血细胞形成、内脏的分化和其它生长因子基因的调节等方面也扮演着重要角色。它对于细胞的增殖、凋亡、分化和形态遗传都起着重要作用。Ⅰ型胶原分子共由3条链组成,包括2条α1链和1条β2链,每条链大约由1000个氨基酸残基组成。 Yukna等[14]将含有Ⅰ型胶原细胞结合位点的15个氨基酸序列合成肽(P?15)与羟磷灰石复合后,增强了人成纤维细胞粘附及增殖能力,促进了牙周病患者牙槽骨缺损的修复。而P6肽为模拟Ⅰ型胶原蛋白细胞连接域的一个小肽，它来源于P?15肽，是P?15肽的一部分，包含了P?15肽功能所必需的核心部分?Ile?Ala?。P6肽具有P?15肽的生物功能，其对骨髓间充质细胞的增殖具有促进作用[11]。为了将P6肽和BMP2在促进骨组织修复过程中的优势结合起来，我们构建了融合蛋白P6BMP2，并在大肠杆菌中实现了表达。根据[15]报道，BMP2含有一个肝素连接位点，因此，将表达上清直接上Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow柱进行亲和层析，由于BMP2蛋白在中性盐溶液中的低溶解性，我们在纯化过程中保留了4mol·L-1 尿素，以增加重组蛋白的溶解度[16]，防止重组蛋白沉淀在柱子上。实验结果显示，P6BMP2可以很好地连接到Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow柱，表明P6BMP2中的肝素结合区域的构象未发生改变，从另一个侧面证明了P6BMP2的氨基酸序列及其构象的一致性。我们构建了融合蛋白P6BMP2，并获得了纯品，为进一步深入研究其生物功能、尤其是在动物体内诱导成骨的生物活性奠定了坚实基础。
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